微生物來源藥物制備工藝研究中質量控制要素討論
通過微生物發酵（生物合成）獲得治療疾病的化學或生物學物質，是藥物研發的一個重要途徑，尤其近年來，隨著生物工程技術的迅猛發展，新藥物研發領域得到進一步拓寬。同時，通過對生產菌種的選育和優化獲取優良菌株，提高產品質量和收率，也成為藥物研發的熱點領域之一。生物合成的工藝過程不同于化學反應過程，既涉及生物細胞的生長、生理和繁殖等生命活動過程，又涉及生物細胞分泌的各種酶所催化的生化反應及酶化學反應過程，對產品質量產生影響的因素遠較化學合成反應多且復雜。本文就如何通過菌種來源、鑒定和保藏的源頭控制、發酵和提取工藝研究及工藝參數確立的過程控制的手段把握產品質量展開討論。
微生物發酵法生產藥品的工藝過程大體相同，一般的工藝程序為：生產菌株→孢子制備→種子制備→發酵→發酵液預處理及過濾→提取及精制→成品檢驗→包裝→放行檢驗。一般說來，從孢子制備到發酵屬于“生物合成”范籌，從發酵液預處理到提取精制屬于“化學工程”范籌。無論是“生物合成”還是“化工操作”階段，均存在影響產品質量的重要因素。由于發酵過程的復雜性，通過對生產菌株相關要素的“源頭控制”以及“生物合成”、“化工操作”階段工藝要素的“過程控制”對于確保產品質量更具重要意義。
1、菌種來源
從出發菌（多為野生菌）到工程菌，一般要經過一系列的誘變、選育過程，菌種選育的目的是為改良菌種的特性，能夠得到目標物且符合商業化生產的要求，如：優化產品組份、提高產品質量、抵抗不良條件、簡化生產條件、提高產品收率等。人們從生長在土壤中的放線菌、真菌、細菌中篩選目標物的同時，已拓展到土壤中的稀有放線菌、海洋微生物和生長在特殊環境中的微生物。菌種選育的方法包括經典的自然選育和誘變育種以及現代的雜交育種、原生質體融合、基因工程等菌種選育技術，通過基因工程技術構建新藥產生菌，大大加快了育種速度。選擇出發菌株時應考慮出發菌株的穩定性，盡量挑選純系菌株，以排除異核體與異質體菌株。出發菌株對誘變因素敏感可以提高突變頻率，菌株的生理狀態及不同的生長發育時間與誘變效應密切相關，一般細菌處理其營養體，真菌和放線菌處理它們的孢子，并以對數生長期為佳。翔實的菌種來源資料，應能詳細說明從野生菌種到生產菌株進行了那些處理，以便從源頭掌握產品質量信息。
得到的工程菌應具備一定的遺傳穩定性，需提供傳代10代以上的記錄和研究資料，說明菌株在多次傳代后，生物學特征以及目標物的產生量等是否發生改變、是否發生了變異，以確保菌種在生產中不會發生回復突變；同時，工程菌這種淵源關系的把握不僅便于從源頭掌控藥品質量，而且對于知識產權的保護亦為一種有效措施，比如，采用某機構的標準菌株為出發菌，經一系列誘變、選育得到工程菌生產目標物，但很多機構的標準菌株僅供科學研究使用，如用于商業用途須經許可，否則，將會引發知識產權的法律糾紛，同時，這種做法也不符合菌種篩選的習慣做法；以野生菌為出發菌得到能產生目標物的工程菌在過去幾十年中一致是人們發現新目標物的主要途徑，在菌種選育過程中獲得其遺傳標記，對日后申請知識產權保護、避免法律糾紛具有重要意義，需引起相關關注。
2、菌種鑒定
生產菌株是生物合成的主要基礎，應能保證在特定條件下能夠穩定產生目標物，同時還要具備產量高、遺傳穩定和容易培養等特點。工程菌既是藥物制備過程的微型（生物）反應器，又是參與反應的原材料，因而對于藥品質量的影響是顯而易見的。要求提交菌種鑒定資料，主要目的是判斷菌種的可靠性和特異性，以便從源頭上把握產品的質量信息，確保擬定的制備工藝能夠始終如一地生產出目標產品。提供的菌種鑒定資料應能準確、全面、特異性地把握其特征，有些申報資料僅提供了菌株的形態特征，難以確定生產菌的種屬特征；目前的菌種的分類檢定主要依據細菌的形態學、代謝產物、酶活性和表面抗原等表型特征,這些方法能對菌種進行初步分類。隨著分子生物學的發展,出現了多種對細菌分類、鑒定的DNA 技術,因此，需要提供其形態特征、培養特征、生理生化反應、目標物的胞內胞外含量數據和細胞壁化學組分的研究信息，以確定生產菌的種屬，并結合菌種特點，采用DNA技術，提供專屬性能特定到“株”的菌種鑒別資料。對于獲得微生物次級代謝產物來講，代謝途徑的特異性強，不能保證不同種屬或同一種屬內不同菌株有同樣的生產能力或得到相同的目標物，菌種鑒別應當準確到株。但在具體操作層面可能會存在一些困難，最大問題在于微生物分類學并非成熟的學科，目前對如何分類還存在爭議。對工業上應用較廣泛的放線菌，目前的研究水平也往往只能鑒定到屬或種；16SRNA基因序列分析作為一種較先進的微生物分類手段，特異性和靈敏度較好，可用于檢定生產菌的種屬，但不一定適用于同種不同株的生產菌鑒別。國內企業不像國外的企業，很多都沒有對自己的生產菌株進行遺傳標記，因此菌種鑒別存在困難。但可以結合具體菌株的代謝情況，提供有特異性的分類學證據，菌種鑒別準確到株。
目前申報單位通常的做法是以目標產物的量為生產菌株鑒別的標志，但這種做法存在某種程度上的概念錯誤。特異地積累某種產物并不能作為菌種分類學的關鍵性證據，但可以作為考察菌種遺傳穩定性的重要指標。因此，在進行菌種鑒別時，應當以微生物分類學為基礎，在形態、分子生物學水平進行相應研究，以一系列的特性來標明該菌株異于其它菌株的特征。
對于代謝路徑問題，因目前的研究水平一般可以揭示微生物在合成終產品時的代謝路徑，且明確代謝路徑對控制結構類似物很有幫助，在研究資料中應當提供。但有申請人可能出于保密的考慮，通常不愿意提供，給此類品種的技術評價帶來很大困惑，也對產品注冊進程產生了不利影響。
3、菌種保藏
微生物菌種在多次傳代中會發生遺傳性變異，而且多為退化性變異，久置的菌種還會死亡，所以菌種應妥善保藏，使之能長期保持存活、不退化，以便從源頭保障產品質量的穩定。菌種保藏條件選擇應根據菌種的生理生化特點選擇確定，使得菌體的代謝活動處于不活波的狀態。保藏時，應首選優良純種的休眠體（孢子、芽孢等）在一種最有利于其休眠的環境條件（如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養物質等），以降低菌種代謝活動的速度，達到長期保存的目的。一種較好的保藏方法應能較長期的保存原有菌種的優良特性，一般的保藏方法有定期移植保藏法、液體石蠟封藏法、真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法以及沙土管保藏法和麩皮保藏法等，如何選擇，需根據菌種特點和具體條件經篩選研究確定。
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