靶向不可成藥靶點KRAS[1]
KRAS簡介- RAS是GTPase原癌基因家族成員，包括三個密切相關(guān)的RAS亞型：HRAS、KRAS和NRAS。在所有RAS亞型中，KRAS突變頻率最高，其次是NRAS和HRAS。KRAS突變在胰腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌中尤為常見。在癌癥中最常發(fā)生突變的殘基是G12、G13和Q61。KRAS蛋白存在兩種剪接變體KRAS4A和KRAS4B，其中KRAS4B在人類細(xì)胞中占主導(dǎo)地位。KRAS(Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)基因是編碼GTP/GDP結(jié)合蛋白的原癌基因，屬于GTPase RAS家族。KRAS蛋白作為分子開關(guān)，在GDP結(jié)合的無活性狀態(tài)和GTP結(jié)合的活性狀態(tài)之間循環(huán)。KRAS蛋白分別通過與GTP和GDP結(jié)合，在無活性形式和活性形式之間轉(zhuǎn)換。雖然KRAS蛋白具有內(nèi)在的核苷酸交換和GTP水解，但其細(xì)胞信號傳導(dǎo)狀態(tài)是由鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)激活引起的，如催化GTP結(jié)合的SOS(son of sevenless)和Ras鳥嘌呤核苷酸釋放蛋白，以及GTPase激活蛋白(GAPs)催化的去激活作用，如刺激GTP水解的p120GAP和神經(jīng)纖維蛋白(NF1)。
KRAS GTPase循環(huán)[1]
KRAS結(jié)構(gòu)- KRAS蛋白包含四個結(jié)構(gòu)域。在三種RAS亞型中，N端的第一個結(jié)構(gòu)域是相同的，第二個結(jié)構(gòu)域的序列相似性相對較低。這兩個區(qū)域?qū)RAS蛋白的信號功能都很重要，并共同形成了G-結(jié)構(gòu)域。KRAS蛋白分子量為21 kDa，由6條β-折疊鏈(形成蛋白核心)和5條α螺旋結(jié)構(gòu)組成，形成兩個主要結(jié)構(gòu)域：G結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。KRAS的G結(jié)構(gòu)域由殘基1-166組成，包括GTP結(jié)合口袋，該區(qū)域?qū)τ谙掠涡?yīng)物和GTPase激活蛋白(GAPs)之間的相互作用至關(guān)重要。G結(jié)構(gòu)域是高度保守的，包含負(fù)責(zé)GDP-GTP交換的switch I和switch II區(qū)域。C端是一個包含CAAX (C=半胱氨酸，A=任意脂肪氨基酸，X=任意氨基酸)基序的高變區(qū)，引導(dǎo)翻譯后修飾并決定細(xì)胞膜錨定。該區(qū)域在RAS蛋白的生物活性調(diào)控中起著重要作用。
KRAS的晶體結(jié)構(gòu)[2]
KRAS二級結(jié)構(gòu)的二維示意圖[2]
KRAS信號通路- KRAS是激活一系列信號分子的上游信號傳感器之一，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，并調(diào)控一系列基本的細(xì)胞過程，如細(xì)胞分化、生長、趨化和凋亡。除了上述GTP/GDP結(jié)合外，KRAS信號的激活現(xiàn)在被認(rèn)為是一個多步驟的過程，需要適當(dāng)?shù)腒RAS翻譯后修飾、細(xì)胞膜定位和與效應(yīng)蛋白的相互作用。KRAS蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并不只發(fā)生在細(xì)胞膜上。KRAS對下游信號通路的激活也可以由亞細(xì)胞區(qū)域(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)的信號觸發(fā)。在細(xì)胞外刺激作用下，從失活的RAS-GDP到激活的RAS-GTP的轉(zhuǎn)化進(jìn)一步促進(jìn)了多種信號通路的激活，包括MAPK通路、PI3K通路和Ral-GEFs通路，其中以MAPK通路的特征最為明顯。已知RAS-GTP直接與RAF蛋白結(jié)合，將RAF激酶家族從細(xì)胞質(zhì)招募到膜上，在細(xì)胞膜上二聚化并活化。激活的RAF隨后對其下游底物，即MEK和ERK進(jìn)行一系列磷酸化反應(yīng)，并傳導(dǎo)生長信號。
主要的KRAS效應(yīng)通路[1]
KRAS蛋白的結(jié)晶研究- 高通量結(jié)晶篩選1000+篩選條件
- 上海同步輻射光源 (Shanghai Synchrotron Radiation Facility; SSRF)美迪西參與了上海光源的設(shè)計、建設(shè)和管理，這是一個用于大分子晶體學(xué)的工業(yè)光束線站，大分子光束線于2009年7月開通。
工業(yè)用大分子晶體學(xué)線站卓越的光束線和服務(wù) 更低的成本 3.5 GeV存儲環(huán) 全年運營緊鄰張江高科技園區(qū)和浦東機(jī)場 - 研究案例KRAS-G12D
KRASG12D的篩選
KRASG12D的X射線衍射數(shù)據(jù)KRAS-G12D with MRTX1133
共晶的篩選
共晶的X射線衍射數(shù)據(jù)KRAS-G12D
KRASG12D與7RPZ的結(jié)構(gòu)比較，綠色為PDB ID 7RPZ，粉色為美迪西的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性非常強(qiáng)。KRAS-G12D with MRTX1133
KRASG12D與MRTX1133的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)(7RPZ, PDB)比較，綠色結(jié)構(gòu)為PDB ID 7RPZ，青色為美迪西的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性非常強(qiáng)。KRAS-G12D with MRTX1133
與GDP結(jié)合的KRASG12D與MRTX1133的共晶結(jié)構(gòu)
KRAS靶向藥物的體外研究- 在研究和開發(fā)的初始階段，體外功能分析對候選KRAS靶向藥物的實際評估至關(guān)重要。這些分析為驗證KRAS靶向藥物活性提供了科學(xué)依據(jù)，并提供了支持治療效果的初步證據(jù)。因此，它們在KRAS靶向候選藥物選擇的決策過程中起著關(guān)鍵作用。KRAS細(xì)胞試驗美迪西已經(jīng)驗證了KRAS突變細(xì)胞系的細(xì)胞毒性測試方法，2D和3D試驗均可用于KRAS抑制劑的評估。
通過CellTiter-Glo檢測2D細(xì)胞增殖試驗
- 細(xì)胞毒性試驗(3D)NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity Assay (3D)
以1 μM起始濃度、按1:3連續(xù)稀釋的藥物處理NCl-H358細(xì)胞288 h后，顯微鏡檢測細(xì)胞毒性結(jié)果。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (2D; 3 days)
以1 μM起始濃度、1:3連續(xù)稀釋的藥物處理NCI-H358細(xì)胞72 h后，CTG測定細(xì)胞毒性。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (3D;12 days)
以1 μM起始濃度、1:3連續(xù)稀釋的藥物處理NCI-H358細(xì)胞288 h后，顯微鏡測定細(xì)胞毒性。
- 基于蛋白的生化活性試驗
Kras G12C-SOS1結(jié)合的IC50活性測試篩選試驗化合物
- 鳥嘌呤核苷酸交換試驗
KRAS在含有1mM BODIPY FL-GDP, 20 mM HEPES pH 7.6, 10 mM EDTA, 20 mM硫酸銨和1 mM DTT的溶液中，在4°C下孵育48小時。用20 mM MgCl2溶液停止反應(yīng)。將含有KRAS蛋白的BODIPY-FL-GDP濃縮去除BODIPY-FL-GDP。圖A：試驗方法的MoA
KRAS靶向藥物的藥理藥效學(xué)研究- KRAS突變-CDX模型
Cancer Type Cell Lines KRAS G12C MIA PaCa-2, NCI-H358, UM-UC-3, Calu-1 KRAS G12D GP2D, SW1990, AsPC-1 KRAS G12V SW480, CAPAN-1, NCI-H727 KRAS G13D LoVo, HCT-116, HT15 Medicilon Case: CDX - KRAS Mutation (G12C)
PDX重要突變/過表達(dá)/耐藥模型GENE PDX ID KRAS Mutation PDXM-060C (p.G12V), PDXM-069C (p.G12V),PDXM-075C (p.G12D), PDXM-076C (p.G13D),PDXM-212Li (p.G12D) TP53 Mutation PDXM-060C (p.R273H), PDXM-072C(p.Y234H) PIK3CA Mutation PDXM-075C (p.H1047L), PDXM-092Ga (p.E545G) BCR-ABL Fusion PDXM-242Le ERBB2 Overexpression PDXM-069C, PDXM-016C, PDXM-060C, PDXM-087C, PDXM-104C… ... ... Resistance* PDX ID Docetaxel + Cisplatin PDXM-271O (Ovarian cancer) VDLP + MA + CVAD PDXM-293Le (Leukemia) Radiation PDXM-311(H&N) ... ... * note: these resistance models are not related to KRAS mutation
- Medicilon Case: PDX -- KRAS Mutation (G12D)
Medicilon Case: AMG-510 Resistant Model - Calu-1 (G12C)
野生型肺癌模型
耐藥肺癌模型(通過體內(nèi)治療2個周期(P2)建立，每個周期2個月。這里展示的是P3結(jié)果。
KRAS靶向藥物的藥代動力學(xué)研究- 美迪西為KRAS靶向藥物PK研究的關(guān)鍵參數(shù)提供高質(zhì)量的定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確。美迪西案例：KRAS-PDEδ抑制劑的藥代動力學(xué)KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用是癌癥治療的一個極具吸引力的靶點。設(shè)計并合成了一系列高效的PROTAC PDEδ降解劑。最有潛力的Compound 17f是治療KRAS突變型結(jié)直腸癌的PROTAC PDEδ降解劑。Compound 17f為KRAS-PDEδ相互作用的可成藥性研究提供了新的化學(xué)工具或先導(dǎo)化合物。Compound 17f在SW480結(jié)直腸癌異種移植模型中具有顯著的抑制腫瘤生長作用。這項驗證研究為靶向KRAS-PDEδ相互作用的可成藥性提供了新的策略，并為治療KRAS突變型癌癥提供了有效的先導(dǎo)化合物。
PROTAC策略和KRAS-PDEδ抑制劑Compound 17f[3]
- 采用Sprague-Dawley (SD)大鼠進(jìn)行Compound 17f的藥代動力學(xué)研究。在劑量為50 mg/kg下腹腔注射給藥后，分析Compound 17f在血漿中的濃度。這些試驗由美迪西進(jìn)行。Compound 17f的半衰期約為5.1 h，峰值濃度Cmax為564 ng/mL。雖然Compound 17f的分子量較大(MW=723)，但能在大鼠體內(nèi)有效吸收并達(dá)到足夠的血漿暴露量，其曲線下面積(AUC)值為4710 h·ng/mL。
Compound 17f在大鼠體內(nèi)的PK參數(shù)[3]
美迪西助力KRAS項目舉例- 2022年5月，NMPA批準(zhǔn)了信諾維抗腫瘤1類新藥XNW14010的臨床申請，擬用于治療伴有KRAS G12C突變的晚期實體瘤。XNW14010是一種高選擇性的小分子KRASG12C蛋白共價結(jié)合抑制劑。臨床前實驗數(shù)據(jù)顯示XNW14010在不同的腫瘤模型中均有良好的抗腫瘤活性，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，并具有良好的經(jīng)口給藥藥代動力學(xué)特征和較為理想的安全窗口。美迪西作為信諾維的合作伙伴，為XNW14010的研發(fā)提供了（包括藥代和安全性評價在內(nèi)）綜合性臨床前研究服務(wù)，為項目獲批臨床提供了有力支撐。
- 勁方醫(yī)藥科技（上海）有限公司研發(fā)的氟澤雷塞，是一款高效口服KRAS G12C小分子抑制劑，通過共價不可逆修飾KRAS G12C蛋白突變體半胱氨酸殘基，抑制該蛋白介導(dǎo)的GTP/GDP交換從而下調(diào)KRAS蛋白活化水平。依托成熟的藥代動力學(xué)研究平臺，美迪西為氟澤雷塞提供了早期階段的動物實驗藥物代謝動力學(xué)服務(wù)，助力氟澤雷塞的早期開發(fā)。
- 參考文獻(xiàn)：
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[3]Junfei Cheng, et al. Discovery of Novel PDEδ Degraders for the Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer. J Med Chem. 2020 Jul 23;63 (14):7892-7905. doi: 10.1021/acs.jmedchem.0c00929.
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[5]Tamas Yelland, et al. Stabilization of the RAS:PDE6D Complex Is a Novel Strategy to Inhibit RAS Signaling. J Med Chem. 2022 Feb 10;65 (3):1898-1914. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01265.
[6]Timothy H Tran, et al. KRAS interaction with RAF1 RAS-binding domain and cysteine-rich domain provides insights into RAS-mediated RAF activa-tion. Nat Commun. 2021 Feb 19;12(1):1176. doi: 10.1038/s41467-021-21422-x.
