大鼠帕金森氏病動(dòng)物模型的建立——美迪西生物醫(yī)藥
帕金森氏病(Parkinsonts disease，PD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理變化是中腦黑質(zhì)細(xì)胞變性壞死，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)多巴胺(DA)含量減少而發(fā)病。6一羥多巴胺(6一OHDA)是一種神經(jīng)毒劑，可選擇性破壞含DA 的神經(jīng)細(xì)胞。目前建立帕金森氏病動(dòng)物模型最常用的方法是通過單靶點(diǎn)黑質(zhì)毀損方法，此法由于定位不準(zhǔn)及操作技術(shù)不穩(wěn)等因素，成功率較低。 我們通過紋狀體兩點(diǎn)注射6-OHDA制備大鼠PD 模型，井對(duì)此模型的行為學(xué)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1、材料和方法
1.1 材料
Spraque—Dawley大鼠，雄性，3O只，體重180～ 230g；6-OHDA(sigma公司)；阿樸嗎啡(APO，sigma公司)；兔抗酪氨酸羥化酶(TH)血清(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所惠贈(zèng))；ABC試劑盒(Vector公司)；大鼠腦立體定向儀為江灣一1型(上海江灣醫(yī)療器械廠)。
1.2 方法
將30只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(25只)及對(duì)照組(5只) 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用1O％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉后，剪去頭部毛，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上，切開頭皮和皮下組織、骨膜；將齒棒設(shè)定為一2。4 mm，確定前囟坐標(biāo)，按包新民的大鼠立體定向圖譜確定右側(cè)紋狀體兩點(diǎn)坐標(biāo)，第一點(diǎn)坐標(biāo)是：前囟前1。0，矢狀縫右側(cè)3。0，硬膜下4。5；第二點(diǎn)坐標(biāo)是：前囟后1。0，矢狀縫右側(cè)4。5，硬膜下6。0。 按上述坐標(biāo)用微型磨鉆開顱后，用微量注射器將4 Fg／uL的6一OHDA(溶于0。2 抗壞血酸生理鹽水中)4 分0注入上述兩點(diǎn)，注射速度1~uL／min，注畢留針10 min，退針?biāo)俣葹? mm／min，以防藥液溢出。術(shù)畢大鼠腹腔注射頭孢唑啉(50mg／kg)抗炎。對(duì)照組動(dòng)物僅向兩點(diǎn)注射含0。2 抗壞血酸的生理鹽水4 L，余操作同前。
1周后開始檢測大鼠的誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，每周一次，皮下注射阿樸嗎啡(0.05 mg／kg)誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)行為。動(dòng)物旋轉(zhuǎn)時(shí)以健側(cè)前肢或后肢為支點(diǎn)、身體環(huán)曲、首尾相接的原地旋轉(zhuǎn)，伴覓食樣動(dòng)作。 旋轉(zhuǎn)360度為一轉(zhuǎn)(r)，60 min內(nèi)記錄大鼠向損毀對(duì)側(cè)的旋轉(zhuǎn)瞬數(shù)。
從術(shù)后第1周開始進(jìn)行大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察，每周取1只能產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)的大鼠的腦組織切片，作TH 免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察大鼠右側(cè)中腦黑質(zhì)多巴胺細(xì)胞的損毀情況。TH 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法：大鼠1O%水臺(tái)氯醛(500 mg／kg)深度麻醉后，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注溫生理鹽水100 mL，而后用4℃ 的4％多聚甲醛(pH=7。4，0。1 mol／L PBS)800 mL灌注前固定，迅速斷頭取腦，將腦浸入4 多聚甲醛4℃ 過夜，再移入含30 蔗糖PBS中4℃過夜，直至腦組織沉入容器底部，然后作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚25 m。TH 免疫細(xì)胞化學(xué)染色過翟；切片用5 BSA 室溫孵育1 h TH(1：1500)4℃ 48 h；IgG(1：800)37℃ 2 h；ABC(1：100)37℃ 2 h；DAB顯色10 rain。 各步問PBS充分沖洗。 光鏡下觀察。
2、結(jié)果
紋狀體內(nèi)注射6-OHDA 后l周，所有動(dòng)物都設(shè)有誘發(fā)旋轉(zhuǎn){至術(shù)后第2局才開始出現(xiàn)明
顯的旋轉(zhuǎn)，隨后緩慢上升；至術(shù)后5周才升至較高的水平并保持平穩(wěn)第1、2、3、4、5周動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)次數(shù)分別平均為0。0、3。8、4。9、7。1和8。5 r／rain；其中有15只動(dòng)物達(dá)到或超過了7 r／rain這一通常采用的標(biāo)準(zhǔn)，可作為PD模型鼠使用。成功率為6O 。 5只對(duì)照組大鼠均沒有產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為。酪氮酸羥化酶免疫組化顯示：旋轉(zhuǎn)鼠術(shù)后第1周至第5周右側(cè)黑質(zhì)TH免疫反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少，各個(gè)時(shí)期右側(cè)黑質(zhì)TH免疫反應(yīng)細(xì)胞較對(duì)傭明顯減少。不旋轉(zhuǎn)鼠右側(cè)黑質(zhì)和左側(cè)黑質(zhì)TH 樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元未見明顯差異。
3、討論
帕金森氏病的臨床癥狀主要是由于黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性的退行性改變所造成的，經(jīng)典PD 模型是通過在大鼠的黑質(zhì)或內(nèi)傭前腦束內(nèi)注射6-OHDA 麗復(fù)制的啪。6-OHDA是一種神經(jīng)毒索，黑質(zhì)內(nèi)注射后，它可被大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)富含單胺氧化酶的多巴胺能神經(jīng)元吸收，并在單胺氧化酶作用下轉(zhuǎn)化成自由基而對(duì)神經(jīng)元造成損害。 從神經(jīng)解剖學(xué)的角度來看，黑質(zhì)的傳出纖維主要形成黑質(zhì)紋狀體投射，即纖維自黑質(zhì)發(fā)出后，沿黑質(zhì)背內(nèi)側(cè)上行經(jīng)下丘腦外側(cè)、內(nèi)囊內(nèi)側(cè)部到達(dá)尾狀核頭部和殼核頭部，這一通路含多巴胺也是紋狀體內(nèi)多巴胺的主要來源。 如果黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元被毀損，紋狀體內(nèi)的多巴胺減少，當(dāng)降至一定的水平時(shí)就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的類似PD的癥狀。而對(duì)于單例黑質(zhì)毀損的模型，同側(cè)的黑質(zhì)紋狀體通路被破壞，紋狀體內(nèi)的神經(jīng)元失去多巴胺能神經(jīng)元的支配，其多巴胺受體便處于一種超敏狀態(tài)；當(dāng)給予外源性的多巴胺受體激動(dòng)劑如阿樸嗎啡后，動(dòng)物損傷側(cè)的反應(yīng)就強(qiáng)于健側(cè)而無法保持平衡，并向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)的頻率大致與黑質(zhì)內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元的受損程度一致。黑質(zhì)內(nèi)注射6一OHDA制備PD模型，有以下不足：(1)由于損傷部位緊鄰神經(jīng)元胞體，因此神經(jīng)元的毀損出現(xiàn)很早，在術(shù)后10 rain，應(yīng)用免疫組化方法就可觀察到多巴胺能神經(jīng)元的死亡，這一點(diǎn)使該模型與臨床PD病人的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性死亡不同(2)近距離的毀損很難把握程度，如果想模擬早期PD，則多巴胺能神經(jīng)元的毀損不能超過8O ，用這種方法很難獲得這種部分毀損的模型且模型成功率很低，一般為40 ～50。 鑒于黑質(zhì)內(nèi)注射6一OHDA制備PD模型鼠存在的上述不足，我們通過紋狀體內(nèi)注射6一OHDA制備PD模型鼠。由于紋狀體是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的主要靶區(qū)，注射于其中的6。0HDA可被前者的末梢吸收，通過逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)元胞體，在經(jīng)單胺氧化酶轉(zhuǎn)化成自由基，可選擇性地破壞這些神經(jīng)元而出現(xiàn)類似PD 的癥狀“]。 由于6-OHDA 必須通過逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)才能到達(dá)中腦黑質(zhì)，因此多巴胺能神經(jīng)元的死亡是一種漸進(jìn)的過程。 我們用32~g6一OHDA分兩點(diǎn)注射后，至術(shù)后第2周才開始出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)，隨后緩慢上升}至術(shù)后5周才升至較高的水平并保持平穩(wěn)。第1、2、3、4、5周黑質(zhì)內(nèi)TH 陽性神經(jīng)元存活率逐漸減少；制備模型成功率達(dá)60 。因此無論從形態(tài)學(xué)還是行為學(xué)上來看，這種模型制備方法所造成的多巴胺能神經(jīng)元損傷的確與臨床上PD病人的病程進(jìn)展類似，是一種漸進(jìn)的退變過程。 在對(duì)模型成功鼠持續(xù)1月的觀察中，動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)行為沒有自發(fā)恢復(fù)的現(xiàn)象，動(dòng)物的健康狀況(如運(yùn)動(dòng)、飲食等)也無惡化的表現(xiàn)。
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