在絕大數(shù)藥物靶點(diǎn)中酶學(xué)靶點(diǎn)是一個(gè)大類(lèi)。本文主要以酶催化的基本化學(xué)反應(yīng)原理為起點(diǎn)，概述和闡述下酶催化反應(yīng)的幾個(gè)基本概念Km，Kcat和Ki，以及其測(cè)定方法，分析下一個(gè)靈敏的酶學(xué)篩選方法開(kāi)發(fā)的幾個(gè)關(guān)鍵步驟，概括論述下酶抑制劑的類(lèi)型以及在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中不同類(lèi)型酶抑制劑的IC50和Ki之間的關(guān)聯(lián)。

酶是生命體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的催化劑，能夠在生理溫度和常壓下加快化學(xué)反應(yīng)的速度，幾乎所有的細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程都需要酶的參與以提高效率。特定酶活性或者表達(dá)量的增強(qiáng)或者缺少都有可能導(dǎo)致生命活動(dòng)的異常，疾病的發(fā)生。在藥物研發(fā)過(guò)程中酶是十分重要的靶點(diǎn)，也是十分有潛力和效果的靶點(diǎn)，如最近在中國(guó)上市的吉利德的慢性丙型肝炎新藥索華迪（索磷布韋），其效果和價(jià)格一樣讓人印象深刻，一個(gè)療程6萬(wàn)人民幣左右，對(duì)于基因1，2，3，6型HCV具有抗病毒活性，治愈率高達(dá)92%-100%，其作用的靶點(diǎn)是NS5B RNA聚合酶；又如晚期大腸癌的一線用藥是伊立替康，其代謝活性成分SN-38是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，其與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ及DNA形成的復(fù)合物能引起DNA單鏈斷裂，阻止DNA復(fù)制及抑制RNA合成，為細(xì)胞周期S期特異性。首款獲得FDA批準(zhǔn)的雙藥HIV療法新藥Juluca，其兩個(gè)活性成分，Dolutegravir是HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑（integrase strand transfer inhibitor，INSTI）；Rilpivirine是一款非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）。酶作為一個(gè)很有潛力的靶點(diǎn)，如何建立一個(gè)簡(jiǎn)單高通量的酶學(xué)抑制物的篩選方法是這篇文章筆者主要討論的問(wèn)題。我們可以重溫一下酶學(xué)基本的反應(yīng)原理開(kāi)始酶催化反應(yīng)原理

絕大多數(shù)酶學(xué)反應(yīng)都可以用下圖簡(jiǎn)單的模型進(jìn)行描述：

E代表酶，S代表底物，P代表催化產(chǎn)物。ES代表在催化反應(yīng)開(kāi)始前形成的中間態(tài)產(chǎn)物酶-底物復(fù)合物，E和S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是可逆反應(yīng)的過(guò)程，k1是E和S形成ES復(fù)合物的結(jié)合速率常數(shù)，相當(dāng)于配體受體結(jié)合時(shí)的Kon或者Ka, k-1是ES解離形成E和S的解離速率常數(shù)，相當(dāng)于配體受體結(jié)合時(shí)的Koff或者Kd（關(guān)于以上概念可參考筆者前期的文章--生物功能學(xué)篩選評(píng)價(jià)技術(shù)之親和力評(píng)價(jià)篇）；ES解離形成E和P的過(guò)程在反應(yīng)初期一般認(rèn)為是不可逆的過(guò)程，反應(yīng)產(chǎn)物E會(huì)被反應(yīng)體系中的過(guò)量的S捕捉，k2是ES形成E和P的速率常數(shù)，也被稱(chēng)之為Kcat,相當(dāng)于配體受體結(jié)合時(shí)的Kon或者Ka酶催化效率：

一個(gè)酶相對(duì)于其底物的催化效率主要由兩個(gè)方面決定Kcat/Km， Km值（米氏常數(shù)）越小， Kcat值越大，催化效率越高。Km值的化學(xué)本質(zhì)是E和S可逆反應(yīng)過(guò)程中的解離平衡常數(shù)KD,反映的是E和S親和力的強(qiáng)弱，Km值越小親和力越強(qiáng)，效率越高。Kcat值是ES解離形成E和P的速率常數(shù)。Km值和Kcat值測(cè)定

米氏方程描述了在穩(wěn)態(tài)反應(yīng)條件下酶催化反應(yīng)中初始反應(yīng)速度V和底物濃度 [S]的相關(guān)關(guān)系：

當(dāng)V等于1/2的 Vmax時(shí)，底物濃度 [S]為Km值。

在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟：
1. 少量固定濃度的酶（nM或者pM級(jí)別），梯度濃度稀釋的底物（底物濃度相對(duì)于酶濃度由遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量，mM到μM）進(jìn)行分組，酶催化反應(yīng)；
2. 每個(gè)分組對(duì)酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光，吸光度檢測(cè)或者HPLC檢測(cè)），選取各分組信號(hào)時(shí)間的線性反應(yīng)區(qū)域進(jìn)行V計(jì)算；

3. 選取梯度濃度稀釋的底物動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的線性區(qū)域的斜率作為初始反應(yīng)速度V進(jìn)行數(shù)據(jù)米氏方程擬合，擬合圖形的平臺(tái)期為Vmax, 1/2的Vmax時(shí)V對(duì)應(yīng)的底物濃度值是Km值。處理結(jié)果示意圖如下：

4. 當(dāng)酶催化反應(yīng)達(dá)到最大速度時(shí)，S遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E，所以所有的E均被S捕獲，E和S的逆反應(yīng)速度可忽略不計(jì)，[ES]=[E]

Vmax=[ES]*Kcat=[E] *Kcat,所以Kcat= Vmax/[E]

以上是Km和Kcat的測(cè)定和計(jì)算過(guò)程，值得注意的是在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意以下幾點(diǎn)：

    1.必須是動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，選取初始反映的線性段的斜率作為初始反應(yīng)的速度。終點(diǎn)法讀數(shù)的結(jié)果很多時(shí)候并不可靠，應(yīng)為酶催化反應(yīng)隨著時(shí)間的進(jìn)行底物的消耗，反應(yīng)速度會(huì)從勻速到非均速變化，如果采用終點(diǎn)法可能得到不真實(shí)的初始速度，如下圖：

2. 必須確認(rèn)儀器的檢測(cè)線性，當(dāng)酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物的量過(guò)多時(shí)，超過(guò)儀器檢測(cè)的線性區(qū)域時(shí)，檢測(cè)的產(chǎn)物的量不準(zhǔn)，影響到后續(xù)參數(shù)的計(jì)算，如下圖：

酶學(xué)藥物篩選模型的建立

酶學(xué)篩選方法的幾個(gè)核心參數(shù)包括酶，反應(yīng)環(huán)境，底物和抑制物。一般來(lái)講反應(yīng)環(huán)境需要查閱文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)研，確定PH值，離子強(qiáng)度，洗滌劑等對(duì)酶活的影響，底物可以根據(jù)酶催化原理選擇天然底物，也可以選擇合成底物（底物的選擇和后續(xù)配套的檢測(cè)方法緊密相關(guān)）。一個(gè)酶學(xué)方法的開(kāi)發(fā)可能涉及到以下一些因素：

    底物的選擇和配套的檢測(cè)方式，如下圖某蛋白水解酶，其識(shí)別的位點(diǎn)是氨基酸線性表位，可以人工合成多肽，在其N(xiāo)端和C端分別加入熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，正常狀態(tài)下或者酶活抑制狀態(tài)，該多肽在酶標(biāo)儀340nm激發(fā)時(shí)，其發(fā)射光會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收，在405nm無(wú)信號(hào)產(chǎn)生；酶催化反應(yīng)會(huì)將該多肽剪切，當(dāng)酶標(biāo)儀340nm激發(fā)時(shí)，405nm有信號(hào)產(chǎn)生。 

    又如某病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，合成RNA模板和對(duì)應(yīng)引物，在其引物上進(jìn)行生物素標(biāo)記，其中堿基上進(jìn)行Ru標(biāo)記，隨著酶催化的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)行，引物上不斷有Ru標(biāo)記堿基上去形成核苷酸序列，通過(guò)親和素的板子捕捉引物，檢測(cè)Ru信號(hào)值來(lái)評(píng)判酶的催化和抑制的活性。

酶，底物濃度的選擇和反應(yīng)時(shí)間的選擇

    當(dāng)酶對(duì)應(yīng)的底物確定以后，選取少量的酶濃度（pM或者nM）對(duì)底物進(jìn)行Km測(cè)定，選取底物的Km濃度作為篩選的反應(yīng)濃度，選取該濃度下線性的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為反應(yīng)終止或者檢測(cè)的時(shí)間。酶和梯度稀釋的化合物進(jìn)行預(yù)孵育后，加入Km濃度的底物，反應(yīng)一段時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)，這個(gè)就是一般酶學(xué)篩選模型。 

酶抑制劑機(jī)理研究

對(duì)于靶點(diǎn)酶的抑制劑，主要可以歸納為三類(lèi)（competitive競(jìng)爭(zhēng)性, noncompetitive非競(jìng)爭(zhēng)性, uncompetitive不競(jìng)爭(zhēng)性）

    competitive競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑只和自由的酶結(jié)合，通常情況下和底物共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)（活性中心），當(dāng)然也有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和底物互斥的情況出現(xiàn)，兩個(gè)中只有一個(gè)能夠和自由的酶結(jié)合。在競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在的情況下，酶相對(duì)于底物的Km和Vmax測(cè)定時(shí)，測(cè)得得表觀Km值增加，Vmax值不變，如下圖所示，幾種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的圖示： 

noncompetitive非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

    非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可以和自由的酶結(jié)合，也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，抑制劑結(jié)合的位點(diǎn)和活性中心位點(diǎn)不在相同的表位，最終也會(huì)導(dǎo)致酶催化活性的喪失。在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在的情況下，酶相對(duì)于底物的Km和Vmax測(cè)定時(shí)，測(cè)得得表觀Km值不變，Vmax值降低，如下圖所示：

uncompetitive不競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

    不競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑只和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，形成失活的抑制劑-酶-底物復(fù)合物。酶相對(duì)于底物的Km和Vmax測(cè)定時(shí)，測(cè)得得表觀Km值降低，Vmax值降低。如下圖所示：

不同類(lèi)型抑制劑Ki和IC50之間的關(guān)聯(lián)

    Ki描述的是抑制劑和酶的結(jié)合強(qiáng)弱，是抑制劑和酶的解離平衡常數(shù)，是個(gè)狀態(tài)函數(shù)，不會(huì)受到反應(yīng)體系中底物濃度的影響，不同實(shí)驗(yàn)得到的Ki值具有可比性；而IC50則是在特定酶學(xué)檢測(cè)方法中酶活抑制一半時(shí)抑制劑的濃度，根據(jù)不同類(lèi)型的抑制劑，底物濃度可能對(duì)IC50產(chǎn)生影響，不同實(shí)驗(yàn)得到的IC50值不具可比性。根據(jù)不同類(lèi)型的抑制劑，在理想條件下（酶濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于底物濃度進(jìn)行反應(yīng)），Ki和IC50的關(guān)系如下：

    不同抑制劑類(lèi)型IC50和反應(yīng)體系中加入的底物濃度的關(guān)系示意圖如下： 

展望：

絕大多數(shù)生命活動(dòng)的調(diào)控均是有酶的參與，對(duì)酶的選擇性抑制可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程，如JAK抑制劑，IDO抑制劑等在臨床研究或者市場(chǎng)上證明了其價(jià)值或者潛在的價(jià)值。了解酶學(xué)反應(yīng)的化學(xué)原理，搭建合適的酶學(xué)篩選模型；表征酶抑制劑的不同抑制機(jī)理，也有助于細(xì)微區(qū)分不同抑制機(jī)理藥物可能起到的差異性的臨床獲益。
利用酶催化反應(yīng)進(jìn)行體外的功能學(xué)檢測(cè)也是常用的工具，如ELISA中HRP酶的催化顯色，細(xì)胞活性檢測(cè)時(shí)琥珀酸脫氫酶催化的CCK8檢測(cè)，報(bào)告基因檢測(cè)過(guò)程中l(wèi)uciferase酶催化的化學(xué)發(fā)光等，了解其化學(xué)原理和動(dòng)力學(xué)反應(yīng)進(jìn)程有助于功能學(xué)方法學(xué)開(kāi)發(fā)，優(yōu)化檢測(cè)方法的條件。
酶催化反應(yīng)是理解體外生物功能學(xué)評(píng)價(jià)體系承上啟下的一環(huán)，此反應(yīng)過(guò)程描述了是從Binding(affinity)轉(zhuǎn)換到function（potency）的過(guò)程，且在理想條件下此過(guò)程是線性傳遞的，即產(chǎn)物生成量是ES的量和Kcat的乘積，Vp=[ES]*Kcat。與之相對(duì)的，蛋白相互作用過(guò)程中，只有Binding(affinity)，大部分受體介導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)既有Binding(affinity)，也有function（potency），但是由Binding(affinity)到function（potency）之間的傳遞往往是非線性的，每種細(xì)胞由于其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境蛋白的表達(dá)差異性會(huì)導(dǎo)致由胞外結(jié)合引起的刺激非均一放大形成差異性效用。下一篇筆者將會(huì)對(duì)更為復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)相關(guān)測(cè)定方法進(jìn)行討論。

參考資料
《Guidance for Assay Development & HTS》
SECTION V: ENZYMATIC ASSAYS
SECTION XII: MECHANISM OF ACTION ASSAYSFOR ENZYMES