Ames試驗(yàn)-細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)

2017-07-19

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ICH推薦的標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)組合

組合一

a.細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)
b.體外染色體畸變試驗(yàn)或體外微核試驗(yàn)或體外小鼠淋巴瘤tk試驗(yàn)，這三個試驗(yàn)可以任選其中一個。
c.體內(nèi)微核試驗(yàn)或體內(nèi)骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)；動物給藥后取外周血淋巴細(xì)胞做細(xì)胞遺傳學(xué)分析也可接受，但不常用。

組合二

a.細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)
b.用兩種不同組織做體內(nèi)遺傳毒性評估，通常包含體內(nèi)微核試驗(yàn)和另一個體內(nèi)試驗(yàn)。第二個體內(nèi)試驗(yàn)通常選擇評估動物肝臟DNA鏈斷裂。
細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)是與致癌物檢測最相關(guān)的體外試驗(yàn)。

細(xì)菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)

用于檢測DNA損傷引起的基因突變。通過檢測受試物在測試菌株某些特殊構(gòu)建的突變體上引起突變的能力，即造成菌株從組氨酸/色氨酸依賴型向原養(yǎng)型突變，判斷受試物是否為致突變劑。
試驗(yàn)需在加和不加s9代謝活化系統(tǒng)條件下同時進(jìn)行。
※在培養(yǎng)細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基中加入痕量的組氨酸或色氨酸，允許細(xì)菌前幾個小時生長，表現(xiàn)為背景菌苔。當(dāng)加入的組氨酸/色氨酸用盡后，只有發(fā)生了突變的細(xì)菌才可以繼續(xù)生長成為肉眼可見的回復(fù)突變菌落。

不同類型的Ames試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)類型	培養(yǎng)器皿	實(shí)驗(yàn)時間	受試物用量
標(biāo)準(zhǔn)Ames	100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿	兩周	400mg
Mini-Ames	六孔細(xì)胞培養(yǎng)板	1周	（1）80mg測試五個菌株（2）30mg測試兩個菌株
Micro-Ames	24孔細(xì)胞培養(yǎng)板	1周	15mg
Amesll	384孔板	1周	< 5mg

GLP試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗(yàn)。
在藥物篩選早期常用的試驗(yàn)有Mini-Ames試驗(yàn)、Micro-Ames試驗(yàn)、AmesII試驗(yàn)等，特點(diǎn)是用藥量少。
Mini/Micro Ames試驗(yàn)通常選擇2個菌株（即TA98和TA100，可檢測98%致突變劑），為了消除另外2%的可能性，可選擇與標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗(yàn)相同的5個菌株。
AmesII試驗(yàn)使用菌株TA98和混合菌株TA7001至7006，將細(xì)菌與受試物預(yù)培養(yǎng)及一系列稀釋后，在30℃培養(yǎng)過夜，然后接種到各有選擇性試劑5-FU及pH敏感劑溴甲酚紫的384孔上，通過紫外分光光度計(jì)檢測培養(yǎng)基變黃的程度來判斷受試物致突變性。

Ames試驗(yàn)流程

受試物		澆到平板，孵育48-72小時
菌液
S9混合物/PBS

測試菌株（Ames Test System）

應(yīng)選擇至少5種菌株

TA1535
TA1537或TA97或TA97a
TA98
TA100
WP2 uvrA或WP2 uvrA(pKM101)或TA102

每種菌株在編碼組氨酸/色氨酸生物合成的操縱子上有不同的突變。
國外較多實(shí)驗(yàn)室選用WP2，而國內(nèi)使用TA102較多。

測試菌株基因型和突變類型

菌株	氨基酸標(biāo)記物			其它相關(guān)突變		質(zhì)粒
菌株	突變基因	突變類型	主要基因靶點(diǎn)	膜突變	DNA修復(fù)	質(zhì)粒
TA1535	hisG46	堿基置換	GC	rfa	UVrB	-
TA1537	hisC3076	移碼	GC	rfa	UVrB	-
TA97	hisD6630	移碼	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA97a	hisD6631	移碼	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA98	hisD3052	移碼	GC	rfa	UVrB	pKM101
TA100	hisG46	堿基置換	GC	rfa	UVrB	pKM101
WP2 uvrA	trpE	堿基置換	AT	-	UVrA	-
WP2 uvrA (pKM101)	trpE	堿基置換	AT	-	UVrA	pKM101
TA102	hisG428	堿基置換	AT	rfa	+	pKM101 pAQ1

測試菌株基因型及檢測敏感性

Rfa膜突變的存在增加了細(xì)胞膜對大分子化學(xué)物質(zhì)的通透性
uvrB-菌株的切除修復(fù)功能有缺陷，菌株無法切除DNA加合物，是的這些菌株對大量致突變劑的致突變性和細(xì)菌毒性敏感。
質(zhì)粒pKM101上含有muc+基因，參加DNA損傷誘導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑，在給予細(xì)菌抵抗致突變劑的細(xì)菌毒性同時，提高了易突變性。含有質(zhì)粒pKM101的菌株自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)較高。

TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重復(fù)序列，位于相應(yīng)的組氨酸靶位點(diǎn)內(nèi)的突變敏感部位，他們對導(dǎo)致這些移碼熱點(diǎn)中堿基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似。

TA98和TA100對大部分致突變劑敏感（有數(shù)據(jù)顯示這兩個菌株檢測陽性的致突變劑占98%，因而在前期篩選試驗(yàn)中可只檢測這兩個菌株。）
羥基蒽醌類化合物僅可被菌株TA1537檢測
氧化型突變劑、DNA交聯(lián)劑劑聯(lián)氨僅可被含有AT位點(diǎn)突變的菌株TA102、WP2urA、WP2uvrA(pKM101)檢測
菌株TA1535與TA100都在hisG46基因位點(diǎn)發(fā)燒堿基置換型突變，不同點(diǎn)僅是TA100含有pKM101質(zhì)粒，從而增加突變敏感性。但是專家組通過大量數(shù)據(jù)顯示，在已知的659種致突變劑中約5%受試物僅可被TA1535檢測出，而不是TA100。