編者引言：單克隆抗體藥物進(jìn)入體內(nèi)有著多個(gè)可能的存在形式：游離型、部分結(jié)合型、完全結(jié)合型。抗體藥物體內(nèi)的多種存在形式使得其PK分析方法學(xué)設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，如何考慮待測(cè)分子形式，如何針對(duì)性地設(shè)計(jì)出合適的Assay Format，實(shí)踐中又可能出現(xiàn)什么樣的問題和挑戰(zhàn)，在本文中作者將進(jìn)行詳細(xì)闡述。下面就跟著小編一起往下看吧！

當(dāng)前生物治療性產(chǎn)品中抗體藥物占主要部分，截至2017年，已經(jīng)有60多個(gè)單抗藥物獲批上市，2017年全球銷售額排名前10的藥中，有8個(gè)是大分子藥物，這8個(gè)中單抗藥就占6個(gè)，目前超500種抗體藥物處于臨床開發(fā)階段，國(guó)內(nèi)外抗體藥物開發(fā)的熱度近幾年來(lái)持續(xù)上升。這些抗體產(chǎn)品基本上都是IgG亞型的單克隆抗體。IgG是具有兩個(gè)抗原結(jié)合價(jià)的抗體亞型，這種二價(jià)性使得抗體藥物在體內(nèi)有多種可能的存在形式：二價(jià)的即游離型抗體（mAbfree），單價(jià)的即部分結(jié)合的抗體（Partial bound mAb），結(jié)合了兩個(gè)抗原的抗體即完全結(jié)合的抗體(Total bound mAb)。在進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)時(shí)，需要考慮是否有循環(huán)的、可溶性的抗體藥物靶向結(jié)合的配體分子(Ligand,L)存在，從而明確其多種可能的存在形式。如果抗體藥物靶向結(jié)合的配體是一個(gè)二聚體甚至多聚體，抗體藥物的存在形式可能更為復(fù)雜。鑒于抗體藥物體內(nèi)存在形式的多樣性，可靠的分析方法學(xué)是支持PK/PD研究，評(píng)估劑量-反應(yīng)關(guān)系，評(píng)價(jià)有效性和安全性的關(guān)鍵。

利用抗體的靶向配體分子即靶點(diǎn)分子作為捕獲試劑，以抗Human IgGFc的抗體作為檢測(cè)試劑的配對(duì)夾心模式是一種較為方便和節(jié)約的Assay Format設(shè)計(jì)（參見圖1）。這種Assay Format可以檢測(cè)兩種形態(tài)的抗體藥物，即部分結(jié)合的抗體（Partial bound mAb）與游離抗體(mAbfree)，但不能檢測(cè)到完全結(jié)合的抗體，因此無(wú)法定量mAbtotal。若目標(biāo)基質(zhì)中明確不可能存在游離靶點(diǎn)的干擾或mAb*L復(fù)合物，運(yùn)用此種Assay Format進(jìn)行PK檢測(cè)的確是一種便利的途徑，且此時(shí)檢測(cè)抗體形式也僅可能是游離抗體（mAbfree）。游離靶點(diǎn)的存在，和給藥后mAb*L復(fù)合的形成，靶點(diǎn)的蓄積會(huì)干擾此Assay Format對(duì)mAbtotal的檢測(cè)，但有研究人員提出將mAb*L酸化解離的方法使所有結(jié)合型mAb變成游離的形式，從而達(dá)到基于此Assay Format能檢測(cè)mAbtotal的目的。也有研究人員將此方法進(jìn)行改造，即采用包被有Streptavidin的固相材料，并將用于捕獲的靶點(diǎn)分子進(jìn)行Biotin標(biāo)記與酸化處理的樣品同步加入反應(yīng)體系中達(dá)到盡可能定量mAbtotal的目的，這樣的操作流程類似于ADA檢測(cè)的Bridge ELISA檢測(cè)模式（參見圖２）。

    圖1：靶點(diǎn)捕獲測(cè)游離與部分結(jié)合的抗體

    圖2：基于圖一的改造型靶點(diǎn)捕獲法

抗獨(dú)特型單克隆抗體是一種能夠識(shí)別、結(jié)合另一抗體可變區(qū)的抗體，在抗體藥物的藥代動(dòng)力學(xué)分析上有較多的應(yīng)用。在某一個(gè)特定的抗體分子中，其可變區(qū)中特異性的抗原表位部分，被稱為抗體的獨(dú)特位（idiotope）。對(duì)于某一個(gè)特定的抗體，存在著多個(gè)獨(dú)特位區(qū)域：有些獨(dú)特位和該抗體的抗原結(jié)合互補(bǔ)位完全重合；有些獨(dú)特位位于可變區(qū)的互補(bǔ)位之外；而另外一些獨(dú)特位，除了互補(bǔ)位之外，還包括了可變區(qū)上其它序列。一個(gè)抗體分子中所有獨(dú)特位和互補(bǔ)位統(tǒng)稱為該抗體的獨(dú)特型（參見圖３）,針對(duì)于某一個(gè)抗體分子獨(dú)特型部分的抗體，被稱為抗獨(dú)特型抗體（Anti-idiotype Atibody，Anti-id）。與抗原結(jié)合互補(bǔ)位結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體具有抑制性或中和性，不與抗原互補(bǔ)位結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體不具有抑制性和中和性。采用不同的抗獨(dú)特型抗體設(shè)計(jì)出不同的Assay Format可以針對(duì)性地檢測(cè)到各種形式的單克隆抗體藥物，即游離、部分結(jié)合或完全結(jié)合抗原的單克隆抗體。

    圖3：抗體的獨(dú)特型與獨(dú)特位

以非抑制性的抗獨(dú)特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)作為捕獲試劑，并以非抑制性的抗獨(dú)特型抗體或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測(cè)試劑可以檢測(cè)所有的抗體形式（mAbtotal）(參見圖４,圖5)。以抑制性抗體(Inhibitory Anti-id) 或靶點(diǎn)分子分別作為捕獲試劑、檢測(cè)試劑配對(duì)模式構(gòu)建橋式ELISA（Bridge ELISA），甚至靶點(diǎn)分子和抑制性抗體(Inhibitory Anti-id)配對(duì)使用可實(shí)現(xiàn)僅能檢測(cè)到游離型抗體藥物。（參見圖6）。以抑制性的抗獨(dú)特型抗體捕獲試劑，非抑制性的抗獨(dú)特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測(cè)試劑可以檢測(cè)游離和部分結(jié)合的單價(jià)抗體（參見圖7）。將抑制性的抗獨(dú)特型抗體或靶點(diǎn)分子作為捕獲試劑，采用標(biāo)記mAb藥物與樣品中非標(biāo)記mAb藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗體的方法也可以檢測(cè)游離和部分結(jié)合的單價(jià)抗體，將此種方法的捕獲試劑替換為非抑制性的抗獨(dú)特型抗體也可以檢測(cè)總的抗體藥物（mAbtotal），但競(jìng)爭(zhēng)性的方法更較為難以獲得好的穩(wěn)健性。

    圖4：基于Non-inhibitory Anti-id和抗Hu IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）檢測(cè)mAbtotal

    圖5：基于Non-inhibitory Anti-id作為捕獲和檢測(cè)試劑檢測(cè)mAbtotal‘’

    圖6：基于靶抗原分子配對(duì)作為捕獲和檢測(cè)試劑檢測(cè)mAbfree

    (說明:設(shè)計(jì)時(shí)將圖中的捕獲抗原和檢測(cè)抗原換成抑制型抗獨(dú)特型抗體，或其中一個(gè)抗原替代為抑制性抗獨(dú)特型抗體均可實(shí)現(xiàn)僅檢測(cè)mAbfree ，不再一一圖示)

    圖7：以抑制性和非抑制性抗獨(dú)特型抗體分別為捕獲和檢測(cè)試劑檢測(cè)mAbfree和單價(jià)抗體

對(duì)于結(jié)合型抗體藥物（部分結(jié)合和完全結(jié)合）的檢測(cè)，也可以采用與抗體藥物不具競(jìng)爭(zhēng)性的抗靶點(diǎn)的抗體作為捕獲試劑，以非抑制性的抗獨(dú)特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測(cè)抗體的構(gòu)成的Assay Format進(jìn)行檢測(cè)（圖8）。也有文獻(xiàn)指出，在樣品中添加過量的游離靶向配體分子將mAb轉(zhuǎn)變成mAb*L從而盡可能實(shí)現(xiàn)此Assay Format對(duì)mAbtotal的定量。

    圖8：以非抑制性抗靶點(diǎn)抗體為捕獲試劑檢測(cè)完全結(jié)合和部分結(jié)合抗體

前述不同Assay Format中的檢測(cè)抗體可以根據(jù)靈敏度需要或檢測(cè)模式的需要將HRP標(biāo)記替換為其它不同的分子進(jìn)行標(biāo)記。雖然不同的Assay Format可以針對(duì)性地實(shí)現(xiàn)PK樣品中不同抗體藥物形式的檢測(cè)，但在實(shí)踐中仍然可能面臨許多挑戰(zhàn)和問題值得思考。1）如抗獨(dú)特型抗體雖然可以較好地利用于PK生物分析中，但其制備和篩選有一定的周期和難度，更加消耗成本。2）酸化解離和將游離mAb轉(zhuǎn)化為mAb*L雖可以將對(duì)mAb部分形態(tài)檢測(cè)的Assay format應(yīng)用于mAbtotal的檢測(cè)分析，但酸化后的樣品在加入中和液后解離開的靶點(diǎn)分子還是可能與用于捕獲的靶點(diǎn)分子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，因此給操作上增加了控制難度，解離后的復(fù)合物存在著又結(jié)合回去的可能，酸化是一種促進(jìn)檢測(cè)方法對(duì)游離靶點(diǎn)的耐受性手段，但用于定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性還需要看方法的優(yōu)化程度；抗原抗體反應(yīng)具有可逆性，是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，而游離mAb即使在過量的靶向配體分子存在下也不可能全部轉(zhuǎn)化為mAb*L，此過程對(duì)mAbtotal定量的偏差程度需要有效控制在一定的范圍內(nèi)，有其實(shí)踐中的復(fù)雜性。3）實(shí)踐中我們首先或更容易獲得的配制PK樣品分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的是mAbfree，游離的標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線在定量檢測(cè)結(jié)合型抗體完全合適嗎？含有與游離mAb標(biāo)準(zhǔn)品等摩爾濃度或等質(zhì)量濃度的抗體分子成分的mAb*L復(fù)合物在檢測(cè)過程中的反應(yīng)能力和產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度一致嗎？是不是需要進(jìn)行兩者的間的校正或要另外制備mAb*L復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)品呢？

另外，如果靶點(diǎn)配體分子與藥物結(jié)合外還可能與其它分子結(jié)合時(shí)，方法上如何設(shè)計(jì)和優(yōu)化；如果靶點(diǎn)分子是二聚體或多聚體又會(huì)對(duì)PK分析產(chǎn)生什么樣的挑戰(zhàn)；抗體藥物作為大分子藥物具有潛在的免疫原性，這又會(huì)對(duì)PK分析產(chǎn)生什么樣的影響等等沒有列入此文的討論范圍。隨著各學(xué)科的發(fā)展，新的檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)和實(shí)踐的深入，未來(lái)對(duì)各種形態(tài)的抗體分子檢測(cè)會(huì)更加游刃有余。

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