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蛋白質(zhì)的純化對于蛋白質(zhì)的鑒定，功能，結(jié)構(gòu)及相互作用的研究是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物之當(dāng)中分離純化出所需要得目的蛋白質(zhì)的方法，是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的核心技術(shù)。

蛋白質(zhì)的純化方法主要是利用不同蛋白質(zhì)之間的相似性與差異，依據(jù)蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的差異性將目的蛋白分離出來。蛋白質(zhì)的分離純化根據(jù)蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)可以分為多種方法。

以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子程度上認(rèn)識生命景象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具備生物活性的目標(biāo)物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作觸及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混雜物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分別的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混雜物置于單一物相中，經(jīng)過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分別目標(biāo)，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的運用中必須留意保留生物大分子的完好性，避免酸、鹼、高溫，強烈機械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備通常分為以下四個階段：選擇材料和預(yù)解決，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分別，提取和純化，濃細(xì)、單和諧保留。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗?zāi)繕?biāo)來判別。對于微生物，應(yīng)留意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，能夠獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：

（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；

（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并留意植物品種和生長發(fā)育情況不同，其中所含生物大分子的量變革很大，另外與季節(jié)性關(guān)系親密。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐盛的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等解決。另外，對預(yù)解決好的材料，若不立刻進行實驗，應(yīng)冷凍保留，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。

蛋白質(zhì)的分離純化

一、蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采取不同溶劑提取分別和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)鞏固性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1—5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點思索提取蛋白質(zhì)和酶時通常采取低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以進程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面著重議論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具備等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH領(lǐng)域內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)避免過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變革，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變革，通常來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度

稀濃度可增進蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分聯(lián)結(jié)，具備保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，通常以0。15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采取0。02—0。05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質(zhì)聯(lián)結(jié)比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)勝，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度領(lǐng)域內(nèi)（度為10％，40度為6。6％）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇領(lǐng)域較廣，也適用于動植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：

（一）依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分別方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯然影響，通常在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增長，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度延續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種景象稱鹽析，將大批鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并積淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。因為各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混雜蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段積淀。

影響鹽析的因素有：

（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，通常可在室溫中進行。通常溫度低蛋白質(zhì)溶介度下降。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。

（2）PH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分別的蛋白質(zhì)經(jīng)常攙和著其余蛋白質(zhì)地一起積淀出來（共沉景象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5—3.0％。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。

其中運用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4。1M，即767克／升；0度時飽和溶解度為3。9M，即676克／升），在這一溶解度領(lǐng)域內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都能夠鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其余鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4。5—5。5之間，當(dāng)用其余pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析積淀分別后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的改換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G—25或G—50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點積淀法

蛋白質(zhì)在靜電情況時顆粒之間的靜電斥力最小，因此溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之積淀，但此法很少獨自使用，可與鹽析法聯(lián)結(jié)用。

3、低溫有機溶劑積淀法

用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度下降并析出，此法辨別力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行。

（二）依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分別方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其余小的溶質(zhì)分子經(jīng)過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是依據(jù)分子大小分別蛋白質(zhì)混雜物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。

（三）依據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分別蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐步增長的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，達到各自等電點的pH位置就停滯，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM—纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素），當(dāng)被分別的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。

（四）依據(jù)配體神奇性的分別方法—親和色譜法親和層析法（aflinitychromatography）是分別蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步解決即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很龐雜的蛋白質(zhì)混雜物中分別出來，而且純度很高。這種方法是依據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體（Ligand）的分子能神奇而非共價地聯(lián)結(jié)。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以龐雜的混雜物情勢存在，每品種型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分別（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的獨自或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從龐雜的混雜蛋白質(zhì)中提取出來，因此經(jīng)常采取幾種方法聯(lián)結(jié)使用。

細(xì)胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1／3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。

3、超聲波解決法：用一定功率的超聲波解決細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震動破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50—100毫克菌體／毫升濃度，在1KG至10KG頻率下解決10—15分鐘，此法的缺陷是在解決進程會產(chǎn)生大批的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫辦法。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。

4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在—20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，因為細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

5、化學(xué)解決法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采取十二烷基磺酸鈉（SDS）、脫氧膽酸鈉等細(xì)胞膜損壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采取溶菌酶解決效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物品質(zhì)的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）能夠抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸能夠抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能消除蛋白水解酥生機，但不是全體，還可經(jīng)過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適宜于目標(biāo)物質(zhì)的提取。

濃縮、單調(diào)及保留

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備進程中因為過柱純化而樣品變得很稀，為了保留和鑒定的目標(biāo)，經(jīng)常需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮

經(jīng)過下降液面壓力使液體沸點下降，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2、空氣流動蒸發(fā)濃縮

空氣的流動可使液體加速蒸發(fā)，鋪成薄層的溶液，外表不斷經(jīng)過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達到濃縮目標(biāo)，此法濃縮速度慢，不適于大批溶液的濃縮。

3、冰凍法

生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內(nèi)而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，此后遲緩地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目標(biāo)。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。

4、吸收法

經(jīng)過吸收劑直接受除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必須與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要改換新的直至達到所需要的體積。

5、超濾法

超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）經(jīng)過膜時，溶劑和小分子透過，大分子碰壁保留，這是近年來發(fā)展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具備成本低，操作便捷，條件柔和，能較好地維持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。運用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須依據(jù)工作需要來選用。另外，超濾裝置情勢，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。

用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。此后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當(dāng)緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，因為透析面積增大，因此使透析時間縮短10倍。

二、單調(diào)

生物大分子制備得到產(chǎn)品，為避免變質(zhì)，易于保留，常需要單調(diào)解決，最常用的方法是冷凍單和諧真空單調(diào)。真空單調(diào)適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的單和諧保留，全部裝置包括單調(diào)器、冷凝器及真空單調(diào)原理外，同時增長了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時通常先將待單調(diào)的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，此后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具備蓬松、溶解度好、維持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，適用于各類生物大分子的單調(diào)保留。

三、貯存

生物大分子的鞏固性與保留方法的很大關(guān)系。單調(diào)的制品通常比較鞏固，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無顯然變革，貯藏懇求容易，只需將單調(diào)的樣品置于單調(diào)器內(nèi)（內(nèi)裝有單調(diào)解）密封，維持0—4度冰箱即可，液態(tài)貯藏時應(yīng)留意以下幾點。

1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度能力封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、通常需加入防腐劑和鞏固劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的鞏固劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其鞏固性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子通常保留在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。

3、貯藏溫度懇求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保留，有的則懇求更低，應(yīng)視不同物質(zhì)而定。

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