一、概述

長期毒性試驗(yàn)（重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)）是藥物非臨床安全性評價(jià)的核心內(nèi)容，它與急性毒性、生殖毒性以及致癌性等毒理學(xué)研究有著密切的聯(lián)系，是藥物從藥學(xué)研究進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。

在藥物開發(fā)的過程中，長期毒性試驗(yàn)的目的是通過重復(fù)給藥的動(dòng)物試驗(yàn)表征受試物的毒性作用，預(yù)測其可能對人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床試驗(yàn)受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)。具體包括以下五個(gè)方面：①預(yù)測受試物可能引起的臨床不良反應(yīng)，包括不良反應(yīng)的性質(zhì)、程度、劑量－反應(yīng)關(guān)系和時(shí)間－反應(yīng)關(guān)系、可逆性等；②判斷受試物反復(fù)給藥的毒性靶器官或靶組織；③推測臨床試驗(yàn)的起始劑量和重復(fù)用藥的安全劑量范圍；④提示臨床試驗(yàn)中需重點(diǎn)監(jiān)測的指標(biāo)；⑤還可以為臨床試驗(yàn)中的解毒或解救措施提供參考。必須強(qiáng)調(diào)的是，長期毒性試驗(yàn)的最終目的是為臨床試驗(yàn)和臨床用藥服務(wù)。

藥物開發(fā)的背景和基礎(chǔ)研究資料各不相同，在進(jìn)行長期毒性試驗(yàn)之前應(yīng)對藥物的已有資料進(jìn)行綜合分析，判斷是否可以通過已有資料達(dá)到長期毒性試驗(yàn)的目的，為臨床試驗(yàn)和臨床用藥提供支持。原則上，如果已有資料尚不能達(dá)到長期毒性試驗(yàn)的目的，從保證臨床用藥安全的角度就應(yīng)該進(jìn)行長期毒性試驗(yàn)；反之，則可以不必進(jìn)行長期毒性試驗(yàn)。

藥物的開發(fā)是一個(gè)連續(xù)的、漸進(jìn)的系統(tǒng)工程，長期毒性試驗(yàn)是藥物開發(fā)的一個(gè)有機(jī)組成部分。長期毒性試驗(yàn)不能與藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和其他毒理學(xué)研究割裂，試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮其他藥理毒理研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究結(jié)果。長期毒性試驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)該力求與其他藥理毒理試驗(yàn)結(jié)果互為印證、說明和補(bǔ)充。

長期毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)該在對受試物的認(rèn)知基礎(chǔ)上，遵循 “具體問題具體分析”的原則進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)、同類化合物在國內(nèi)或國外的臨床使用情況、臨床適應(yīng)證和用藥人群、臨床用藥方案、相關(guān)的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究信息等綜合考慮。

二、基本內(nèi)容

（一）受試物

長期毒性試驗(yàn)應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試驗(yàn)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報(bào)告。所用輔料、溶媒等應(yīng)注明批號、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，并符合試驗(yàn)要求。

    在藥物開發(fā)的過程中，若受試物的制備工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究。

（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬或品系的選擇

一般化學(xué)藥物的長期毒性試驗(yàn)采用兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類。理想的動(dòng)物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①對受試物的生物轉(zhuǎn)化與人體相近；②對受試物敏感；③已有大量歷史對照數(shù)據(jù)。基于目前國內(nèi)的現(xiàn)狀，在大多數(shù)長期毒性試驗(yàn)開始時(shí)，尚無法判斷不同種系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體對受試物的生物轉(zhuǎn)化的一致性，通常以大鼠和Beagle 犬或猴作為長期毒性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。某些特殊結(jié)構(gòu)的受試物應(yīng)選用特殊種屬或品系的動(dòng)物進(jìn)行長期毒性試驗(yàn)，必要時(shí)，也可選用疾病模型動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。鼓勵(lì)在長期毒性試驗(yàn)前采用體外試驗(yàn)體系對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬或品系進(jìn)行篩選。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制

長期毒性試驗(yàn)一般選擇正常、健康和未孕的動(dòng)物，動(dòng)物體重差異應(yīng)在平均體重的20％之內(nèi)。動(dòng)物應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定的等級要求，來源、品系、遺傳背景清楚，并具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證。應(yīng)根據(jù)研究期限的長短和受試物臨床應(yīng)用的患者群確定動(dòng)物的年齡。動(dòng)物年齡應(yīng)盡量一致，一般大鼠為6～9 周齡，Beagle 犬為6～12 月齡。

3. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別和數(shù)量

一般情況下，長期毒性試驗(yàn)中每個(gè)試驗(yàn)組應(yīng)使用相等數(shù)量的雌、雄動(dòng)物。每組動(dòng)物的數(shù)量應(yīng)能夠滿足試驗(yàn)結(jié)果的分析和評價(jià)的需要。一般大鼠為雌、雄各10～30 只，Beagle 犬或猴為雌、雄各3～6 只。

（三）給藥方案

1. 給藥劑量

長期毒性試驗(yàn)一般至少設(shè)高、中、低三個(gè)劑量給藥組和一個(gè)溶媒（或輔料）對照組，必要時(shí)還需設(shè)立空白對照組或陽性對照組。因?yàn)槔碚撋先后w中毒性反應(yīng)的發(fā)生率隨暴露量的增加而增加，所以高劑量原則上應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至出現(xiàn)個(gè)別動(dòng)物死亡。低劑量原則上應(yīng)高于動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)的等效劑量，并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)。為考察毒性反應(yīng)劑量-反應(yīng)關(guān)系，應(yīng)在高劑量和低劑量之間設(shè)立中劑量。

2. 給藥途徑

原則上應(yīng)與臨床用藥途徑一致，否則應(yīng)說明原因。

3. 給藥頻率

原則上長期毒性試驗(yàn)中動(dòng)物應(yīng)每天給藥，給藥期限長（3 個(gè)月或以上）的藥物每周至少應(yīng)給藥6 天。特殊類型的受試物由于其毒性特點(diǎn)和臨床給藥方案等原因，應(yīng)根據(jù)具體藥物的特點(diǎn)設(shè)計(jì)給藥頻率。

4. 給藥期限

長期毒性試驗(yàn)的給藥期限通常與擬定的臨床療程、臨床適應(yīng)證和用藥人群有關(guān)。

臨床單次用藥的藥物，給藥期限為2 周的長期毒性試驗(yàn)通常可支持其進(jìn)行臨床試驗(yàn)和生產(chǎn)。

臨床療程不超過2 周的藥物，給藥期限為1 個(gè)月的長期毒性試驗(yàn)通常可支持其進(jìn)行臨床試驗(yàn)和生產(chǎn)。

臨床療程超過2 周的藥物，可以在臨床前一次性進(jìn)行支持其進(jìn)入III 期臨床試驗(yàn)（及生產(chǎn)）的長期毒性試驗(yàn)；也可以通過不同給藥期限的長期毒性試驗(yàn)來分別支持其進(jìn)入I 期、II 期或III 期臨床試驗(yàn)（及生產(chǎn)）。一般1 個(gè)月的長期毒性試驗(yàn)可支持用藥時(shí)間不超過2 周的I期臨床試驗(yàn)。

通過給藥期限較短的毒性研究獲得的信息，可以為給藥期限較長的毒性研究設(shè)計(jì)提供給藥劑量、給藥頻率等方面的參考；同時(shí)，臨床試驗(yàn)中獲得的信息有助于給藥期限較長的動(dòng)物毒性研究方案的設(shè)計(jì)，降低藥物開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

    以不同給藥期限的長期毒性試驗(yàn)來分別支持藥物進(jìn)入I 期、II 期或III 期臨床試驗(yàn)（及生產(chǎn)）時(shí)，不同給藥期限的長期毒性試驗(yàn)的內(nèi)容應(yīng)完整、規(guī)范，對結(jié)果的分析評價(jià)應(yīng)科學(xué)、合理。

（四）檢測指標(biāo)和檢測時(shí)間

除必需的檢測指標(biāo)外，長期毒性試驗(yàn)應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)，有針對性地增加相應(yīng)的檢測指標(biāo)。

試驗(yàn)前，嚙齒類動(dòng)物至少應(yīng)進(jìn)行5 天的適應(yīng)性觀察，非嚙齒類動(dòng)物至少應(yīng)馴養(yǎng)觀察1～2 周，應(yīng)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行外觀體征、行為活動(dòng)、攝食量和體重檢查，非嚙齒類動(dòng)物還至少應(yīng)進(jìn)行2 次體溫、心電圖、血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)等的檢測。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)指標(biāo)的歷史背景數(shù)據(jù)在長期毒性試驗(yàn)中也具有重要的參考意義。

試驗(yàn)期間，應(yīng)對動(dòng)物進(jìn)行外觀體征、行為活動(dòng)、攝食量、體重、糞便性狀、給藥局部反應(yīng)、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)等的觀測。非嚙齒類動(dòng)物還應(yīng)進(jìn)行體溫、心電圖、眼科檢查和尿液分析。應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)周期的長短和受試物的特點(diǎn)確定檢測時(shí)間和檢測次數(shù)。原則上應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，并反映出觀測指標(biāo)或參數(shù)的變化與給藥期限的關(guān)系。

給藥結(jié)束后，應(yīng)對動(dòng)物（除恢復(fù)期觀察動(dòng)物）進(jìn)行全面的大體解剖，主要臟器應(yīng)稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。組織病理學(xué)檢查對判斷動(dòng)物的毒性靶器官或靶組織具有重要的意義，病理學(xué)檢查報(bào)告應(yīng)經(jīng)檢查者簽名和病理檢查單位蓋章，如發(fā)現(xiàn)有異常變化，應(yīng)附有相應(yīng)的組織病理學(xué)照片。非嚙齒類動(dòng)物對照組和各給藥組主要臟器組織均應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；嚙齒類動(dòng)物對照組和高劑量給藥組動(dòng)物，以及尸檢異常者應(yīng)詳細(xì)檢查，如某一組織發(fā)生病理改變，其他劑量組動(dòng)物該組織也應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

    長期毒性試驗(yàn)應(yīng)在給藥結(jié)束后對部分動(dòng)物進(jìn)行恢復(fù)期觀察，以了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應(yīng)。應(yīng)根據(jù)受試物的代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)、靶器官或靶組織的毒性反應(yīng)和恢復(fù)情況確定恢復(fù)期的長短。

（五）毒物代謝動(dòng)力學(xué)

毒物代謝動(dòng)力學(xué)（簡稱毒代動(dòng)力學(xué)）系指結(jié)合長期毒性試驗(yàn)進(jìn)行的考察藥物系統(tǒng)暴露的代謝動(dòng)力學(xué)研究。毒代動(dòng)力學(xué)可以描述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的系統(tǒng)暴露與暴露劑量、暴露時(shí)間和毒理學(xué)結(jié)果之間的關(guān)系。本指導(dǎo)原則中毒代動(dòng)力學(xué)研究的主要目的在于解釋長期毒性試驗(yàn)的結(jié)果。

毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)應(yīng)選擇合適的時(shí)間點(diǎn)采樣測定，從而獲得藥時(shí)曲線下面積（AUC ）、峰濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）等參數(shù)。某些藥物應(yīng)結(jié)合藥物血漿蛋白結(jié)合率來評價(jià)系統(tǒng)暴露量。毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以來自長期毒性試驗(yàn)的全部動(dòng)物，也可以來自部分動(dòng)物。建議此部分動(dòng)物應(yīng)包括低、中、高劑量組的動(dòng)物，以便估算高劑量藥物在動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程是否屬非線性動(dòng)力學(xué)過程。

三、結(jié)果分析及評價(jià)

    長期毒性試驗(yàn)的最終目的在于預(yù)測人體可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。只有通過研究結(jié)果的科學(xué)分析和評價(jià)才能夠清楚描述動(dòng)物的毒性反應(yīng)，并推斷其與人體的相關(guān)性。長期毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析和評價(jià)是長期毒性試驗(yàn)的必要組成部分，必須對研究結(jié)果進(jìn)行科學(xué)和全面的分析和評價(jià)。

（一）研究結(jié)果的分析

分析長期毒性試驗(yàn)結(jié)果的目的是判斷動(dòng)物是否發(fā)生毒性反應(yīng)，描述毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度（包括毒性起始時(shí)間、程度、持續(xù)時(shí)間以及可逆性等）和靶器官，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機(jī)制。

1. 正確理解試驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義

在對長期毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)正確理解均值數(shù)據(jù)和單個(gè)數(shù)據(jù)的意義。嚙齒類動(dòng)物長期毒性試驗(yàn)中組均值的意義通常大于單個(gè)動(dòng)物數(shù)據(jù)的意義，實(shí)驗(yàn)室歷史背景數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以為結(jié)果的分析提供參考。非嚙齒類動(dòng)物數(shù)量少、個(gè)體差異大，因此單個(gè)動(dòng)物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)往往具有重要的毒理學(xué)意義。此外，非嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果必須與給藥前數(shù)據(jù)、對照組數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室歷史背景數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)參考價(jià)值有限。

在分析長期毒性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)綜合考慮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義。正確利用統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)有助于確定試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并不一定代表具有生物學(xué)意義。在判斷生物學(xué)意義時(shí)應(yīng)考慮到參數(shù)變化的劑量-反應(yīng)關(guān)系、其他相關(guān)參數(shù)的改變，以及與歷史背景數(shù)據(jù)的比較。

此外，在對長期毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)對異常數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的解釋。

2. 正確判斷毒性反應(yīng)

    給藥組和對照組之間檢測參數(shù)的差異可能來自于與受試物有關(guān)的毒性反應(yīng)、動(dòng)物對藥物的適應(yīng)性改變或正常的生理波動(dòng)。在分析試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)關(guān)注參數(shù)變化的劑量－反應(yīng)關(guān)系、組內(nèi)動(dòng)物的參數(shù)變化幅度和性別差異，同時(shí)綜合考慮多項(xiàng)毒理學(xué)指標(biāo)的檢測結(jié)果，分析其中的關(guān)聯(lián)和作用機(jī)制，以正確判斷藥物的毒性反應(yīng)。單個(gè)參數(shù)的變化往往并不足以判斷化合物是否引起毒性反應(yīng)，可能需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的研究。此外毒代動(dòng)力學(xué)研究可以為毒性反應(yīng)和毒性靶器官或靶組織的判斷提供重要的參考依據(jù)。

（二）動(dòng)物毒性反應(yīng)對于臨床試驗(yàn)的意義

將長期毒性試驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)，不可避免地會(huì)涉及到受試物在動(dòng)物和人體內(nèi)毒性反應(yīng)之間的差異。首先，不同物種、同物種不同種屬或個(gè)體之間對于某一受試物的毒性反應(yīng)可能存在差異；其次，由于在長期毒性試驗(yàn)中通常采用較高的給藥劑量，受試物可能在動(dòng)物體內(nèi)呈非線性動(dòng)力學(xué)代謝過程，從而導(dǎo)致與人體無關(guān)的毒性反應(yīng)；另外，長期毒性試驗(yàn)難以預(yù)測一些在人體中發(fā)生率較低的毒性反應(yīng)或僅在小部分人群中出現(xiàn)的特異質(zhì)反應(yīng)；同時(shí)有些毒性反應(yīng)目前在動(dòng)物中難以檢測，如頭痛、頭昏、頭暈、腹脹、皮膚搔癢、視物模糊等。鑒于以上原因，動(dòng)物長期毒性試驗(yàn)的結(jié)果一般不會(huì)完全再現(xiàn)于人體臨床試驗(yàn)。但如果沒有試驗(yàn)或文獻(xiàn)依據(jù)證明受試物對動(dòng)物的毒性反應(yīng)與人體無關(guān)，在進(jìn)行藥物評價(jià)時(shí)必須首先假設(shè)人最為敏感，長期毒性試驗(yàn)中動(dòng)物的毒性反應(yīng)將會(huì)在臨床試驗(yàn)中再現(xiàn)。

    進(jìn)行深入的作用機(jī)制研究將有助于判斷動(dòng)物和人體毒性反應(yīng)的相關(guān)性。

（三）綜合評價(jià)

長期毒性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性研究的有機(jī)組成部分，是藥物非臨床毒理學(xué)研究中綜合性最強(qiáng)、獲得信息最多和對臨床指導(dǎo)意義最大的一項(xiàng)毒理學(xué)研究。對其結(jié)果進(jìn)行評價(jià)時(shí)，應(yīng)結(jié)合受試物的藥學(xué)特點(diǎn)，藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和其他毒理學(xué)研究的結(jié)果，以及已取得的臨床研究的結(jié)果，進(jìn)行綜合評價(jià)。對于長期毒性試驗(yàn)結(jié)果的評價(jià)最終應(yīng)落實(shí)到受試物的臨床不良反應(yīng)、臨床毒性靶器官或靶組織、安全范圍、臨床需重點(diǎn)檢測的指標(biāo)，以及必要的臨床監(jiān)護(hù)或解救措施。