據(jù)2018年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌在全球女性癌癥中的發(fā)病率為24.2%，占據(jù)女性癌癥的首位，其中52.9%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。從發(fā)病年齡來(lái)看，乳腺癌發(fā)病率從20歲以后開(kāi)始逐漸上升，45~50歲達(dá)到峰值。

三陰性乳腺癌（TNBC）是所有乳腺癌中的一種，因雌激素受體、孕激素受體和HER-2三個(gè)主要治療靶點(diǎn)均為陰性而被稱為“三陰”，約占所有乳腺癌的15%左右。這種乳腺癌由于缺乏靶點(diǎn)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高，而被認(rèn)為是“最毒、最兇險(xiǎn)”的乳腺癌。其中，因經(jīng)歷過(guò)多輪治療后病情仍然進(jìn)展的三陰性乳腺癌更是接近“山窮水盡”，經(jīng)常規(guī)方案治療后腫瘤縮小的患者比例不到10%。

自然界充滿了對(duì)我們有害的化合物，但是醫(yī)學(xué)科學(xué)家們一直向我們展示如何利用它們來(lái)造福人類甚至變成可以救命的藥物。近日，澳大利亞科學(xué)家的一項(xiàng)突破性發(fā)現(xiàn)就是最新的例子，該團(tuán)隊(duì)展示了蜜蜂毒液中的一種成分如何可以用作抗乳腺癌的“極強(qiáng)效”武器。這項(xiàng)研究是在澳大利亞哈里·珀金斯醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行的，之前我們已經(jīng)看到過(guò)蜂毒中的某些肽和蛋白質(zhì)如何用于跨血腦屏障運(yùn)送藥物，但Duffy博士的研究重點(diǎn)在于如何將其用于治療各種乳腺癌。她的研究重點(diǎn)是蜜蜂毒液中一種稱為蜂毒肽的活性化合物，以及它如何在不同臨床亞型的乳腺癌中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。該研究發(fā)表在《自然精密腫瘤學(xué)》雜志上。

蜜蜂毒液和蜂毒肽可特異性降低乳腺癌細(xì)胞的生存能力

為了評(píng)估抗癌功效和選擇性，研究人員評(píng)估了從澳大利亞收集的蜜蜂毒液，毒液顯示出很高的抗癌選擇性，在TNBC和富含HER2的乳腺癌細(xì)胞系中具有更高的效力，其次是腔內(nèi)乳腺癌細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的影響最小。

研究人員開(kāi)發(fā)了一種識(shí)別蜂毒素的小鼠單克隆抗體，以通過(guò)ELISA評(píng)估所有蜜蜂和大黃蜂毒液樣品中蜂毒素的相對(duì)豐度。根據(jù)上述活性研究，蜂毒素的相對(duì)豐度在不同位置的所有蜜蜂毒液樣品中均無(wú)顯著差異（雙向方差分析，p>0.999）。但是，與大黃蜂毒液和同種型IgG對(duì)照相比，蜜蜂樣品中蜂毒肽的濃度明顯更高。

蜂毒肽的抗癌作用通過(guò)體外阻斷實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，在該實(shí)驗(yàn)中研究人員利用抗蜂毒肽抗體拯救了HDFa和SUM159細(xì)胞的細(xì)胞活力。這些數(shù)據(jù)表明，蜜蜂毒液中存在的蜂毒肽是所研究的毒液中最突出的生物活性抗癌化合物。

蜜蜂毒液和蜂毒肽可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡

為了查明細(xì)胞死亡的機(jī)制，用蜜蜂毒液或蜂毒肽的IC50分別處理TNBC細(xì)胞18和24小時(shí)，并通過(guò)裂解的caspase-3分析處理以量化凋亡細(xì)胞的死亡。免疫印跡證實(shí)了在SUM159細(xì)胞中裂解的caspase-3的誘導(dǎo)，單獨(dú)的蜂毒肽在治療后18和24h均比蜜蜂毒液能誘導(dǎo)更高的癌細(xì)胞凋亡水平。

為了量化治療后的凋亡、壞死或死亡細(xì)胞群體，研究人員進(jìn)行了膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析。使用IC50濃度將SUM159細(xì)胞暴露于媒介物、蜜蜂毒液或蜂毒素，并在60分鐘處理后通過(guò)流式細(xì)胞儀處理。研究人員發(fā)現(xiàn)與蜜蜂毒液（8.3±1.9％）和媒介物對(duì)照（4.8±0.4％）相比，經(jīng)蜂毒素處理的樣品（23.6±5.7％）的晚期凋亡或壞死細(xì)胞明顯增多（23.6±5.7％），然而早期凋亡或壞死細(xì)胞水平均無(wú)顯著差異。為了表征較短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞死亡的動(dòng)力學(xué)，測(cè)量了用IC50濃度的蜂毒肽處理長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)的HDFa、SKBR3和SUM159細(xì)胞的細(xì)胞活力。蜜蜂毒液會(huì)迅速降低細(xì)胞活力，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞系在一小時(shí)內(nèi)沒(méi)有顯著差異。相反，從10分鐘起，蜂毒肽與正常細(xì)胞相比顯著降低了兩種乳腺癌細(xì)胞的活力，從30分鐘起，SUM159顯著高于SKBR3（雙向ANOVA，p < 0.0001）。SKBR3和SUM159細(xì)胞中的活細(xì)胞共聚焦顯微鏡檢查和掃描電子顯微鏡檢查說(shuō)明，用蜂毒和蜂毒肽處理相對(duì)于媒介物處理在10至60分鐘內(nèi)質(zhì)膜會(huì)迅速破裂和收縮。

蜜蜂毒液和蜂毒肽抑制RTK磷酸化

在SUM159中，蜜蜂毒液和蜂毒素在10到20分鐘內(nèi)顯著下調(diào)了p-EGFR，在MAPK和Akt途徑SUM159細(xì)胞由于負(fù)調(diào)節(jié)反饋回路觸發(fā)ERK信號(hào)，以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡細(xì)胞死亡的釋放?？狗涠径舅乜贵w表明，隨著時(shí)間的推移，兩種細(xì)胞系的裂解物中蜂毒素的含量均增加，與蜜蜂毒液相比兩種細(xì)胞系中蜂毒素處理的信號(hào)更強(qiáng)。為了表征另一種TNBC模型中對(duì)信號(hào)通路的影響，研究人員對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了免疫印跡分析，其中EGF處理使EGFR磷酸化并誘導(dǎo)EGFR表達(dá)。與SUM159細(xì)胞不同，EGF對(duì)EGFR的刺激與p-Akt磷酸化的增加并不相關(guān)，這可能是由于EGFR信號(hào)傳導(dǎo)與Akt途徑之間的分離所致。

考慮到富含TNBC和HER2的乳腺癌細(xì)胞高度依賴EGFR和HER2的激活，研究人員進(jìn)行了生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）實(shí)驗(yàn)，以確定蜂毒肽是否干擾EGF與EGFR的結(jié)合。TAMRA-EGF和FITC-DEDE-melittin的BRET信號(hào)呈劑量依賴性增加，而FITC-melittin的幅度較小。在相同濃度下，F(xiàn)ITC-DEDE-melittin的BRET比比FITC-melittin高得多，并且在每個(gè)劑量下均能很快達(dá)到最大BRET比。為了確定蜂毒肽在EGF結(jié)合位點(diǎn)與EGFR結(jié)合的特異性進(jìn)行了飽和BRET分析以評(píng)估EGF與每種結(jié)合NanoLuc-EGFR的肽的競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)存在1 μM EGF時(shí)，TAMRA-EGF與NanoLuc-EGFR的結(jié)合達(dá)到飽和并顯著降低，而FITC蜂毒蛋白和FITC-DEDE-melittin的BRET信號(hào)不飽和，并且在有或沒(méi)有1 μM EGF的情況下均無(wú)顯著差異，這表明蜂毒肽和DEDE-melittin均未結(jié)合在EGF結(jié)合位點(diǎn)。

總之蜂毒肽通過(guò)存在于C端的帶電序列整合到癌細(xì)胞的質(zhì)膜中，從而誘導(dǎo)質(zhì)膜重塑和破壞。BRET數(shù)據(jù)表明蜂毒肽可以位于距RTK 10 nm以內(nèi)的位置，而不會(huì)干擾內(nèi)源性生長(zhǎng)因子結(jié)合位點(diǎn)。

結(jié)果與討論

研究表明蜜蜂毒液和蜂毒肽可抑制配體誘導(dǎo)的EGFR和HER2磷酸化，從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中的下游信號(hào)通路。蜂毒肽也可進(jìn)入細(xì)胞，以直接或間接地方式調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。蜂毒肽對(duì)HER2驅(qū)動(dòng)的腫瘤的選擇性還為與HER2靶向藥物聯(lián)合使用提供了進(jìn)一步的案例，蜂毒肽的膜破壞特性可以增強(qiáng)其細(xì)胞毒性有效載荷的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)。

研究人員還揭示了修飾蜂毒肽特定區(qū)域的新機(jī)會(huì)，以進(jìn)一步提高惡性細(xì)胞的效力和靶向特異性。經(jīng)工程改造的靶向肽，例如RGD1-melittin，可以在靜脈內(nèi)遞送，以實(shí)現(xiàn)更具選擇性的歸巢和攝取到腫瘤細(xì)胞中。但在人體試驗(yàn)之前，將需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究這些肽的毒性和最大耐受劑量。

蜂毒肽可在全球范圍內(nèi)使用，并在一些偏遠(yuǎn)或不發(fā)達(dá)地區(qū)提供經(jīng)濟(jì)高效且易于使用的治療選擇。目前需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估某些基因型蜜蜂的毒液是否具有更強(qiáng)的或特定的抗癌活性可以加以利用。總體而言，此項(xiàng)研究結(jié)果可用于輔助開(kāi)發(fā)與頻繁耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)的多種癌癥的新治療方式。美迪西作為新藥研發(fā)CRO也會(huì)持續(xù)關(guān)注此項(xiàng)研究進(jìn)展，希望能為乳腺癌新藥研發(fā)助力。