肥胖和代謝綜合征人數(shù)在全世界范圍內(nèi)迅速增長，并會導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。醫(yī)療界一直在重點關(guān)注著肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)展預(yù)防和治療策略。在哺乳動物中，棕色脂肪組織（BAT）和白色脂肪組織（WAT）均可促進全身能量穩(wěn)態(tài)，但是它們的解剖結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能卻大不相同。

BAT的激活增加能量消耗，它的活性與身體質(zhì)量指數(shù)和脂肪量成反比，這使得BAT有望成為一個抗肥胖治療劑。BAT由于其獨特的解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）表達而產(chǎn)生熱量，該蛋白通過將質(zhì)子動力與三磷酸腺苷的產(chǎn)生解偶聯(lián)來耗散能量。盡管UCP1的表達在基礎(chǔ)條件下僅限于BAT，但長時間的冷暴露或β3-腎上腺素刺激不僅可以增加BAT中UCP1介導(dǎo)的產(chǎn)熱能力，還可以激活WAT中褐色樣米色脂肪細(xì)胞的聚集。在成人中，WAT分布在全身并位于淺層脂肪墊上；但BAT存在于深層脂肪墊的較小區(qū)域，例如子宮頸、鎖骨上和椎旁區(qū)域?？紤]到其豐富性和特殊位置，WAT更容易獲得和操縱。WAT誘導(dǎo)的褐變可能具有預(yù)防或治療肥胖癥和與肥胖相關(guān)的代謝異常的巨大潛力。

在先前的研究中已經(jīng)表明，小鼠UCP1的異位表達可以使骨骼肌和脂肪組織免受飲食誘導(dǎo)的肥胖，豬缺乏功能性的UCP1基因，而白色脂肪中UCP1的異位表達促進了脂解和耐寒性。這些研究清楚地證明了異位過表達的UCP1在動物中的抗肥胖作用。然而，尚不清楚通過激活內(nèi)源性UCP1基因座位能否在人類中重現(xiàn)這些作用。

自體細(xì)胞療法是一種優(yōu)選的治療干預(yù)措施，其中將細(xì)胞取自個體并施用于同一個體以使免疫排斥最小。自體細(xì)胞療法一直是非常活躍的研究領(lǐng)域，如CRISPR。CRISPR-Cas9系統(tǒng)為哺乳動物細(xì)胞中的基因組編輯提供了強大的手段，并且已經(jīng)在CRISPR-Cas9的基礎(chǔ)上開發(fā)了幾種新工具來實現(xiàn)基因表達的靶向抑制或激活。在CRISPR激活技術(shù)中，將核酸酶失活的Cas9與反式激活域融合，并由靶向特定啟動子的單向?qū)NA指導(dǎo)，該合成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物可以激活內(nèi)源基因的表達。CRISPR激活系統(tǒng)已被用于驅(qū)動各種小鼠和人類細(xì)胞類型的分化、轉(zhuǎn)分化和重編程。然而，尚未測試過CRISPR工程改造的細(xì)胞對全身代謝的影響及其對抗肥胖和與肥胖相關(guān)疾病的治療潛力。

CRISPR激活的高級版本之一是協(xié)同激活介體（SAM）系統(tǒng)，其中dCas9與融合蛋白結(jié)合，該融合蛋白由來自激活B細(xì)胞核因子κ輕鏈增強子（NF-κB）的兩個轉(zhuǎn)錄激活域組成和熱休克因子1（HSF1）協(xié)同促進轉(zhuǎn)錄。近日，研究人員在人類白色前脂肪細(xì)胞中使用了CRISPR-SAM系統(tǒng)來激活UCP1基因表達。除了表征這些CRISPR工程化的人類細(xì)胞外，還通過治療小鼠的肥胖癥和代謝紊亂證明了這些細(xì)胞的治療潛力。該項研究成果發(fā)表在《Science Translational Medicine》上。

CRISPR-SAM對UCP1的內(nèi)源性激活觸發(fā)了人類白色脂肪細(xì)胞中的褐色樣表型

研究人員采用了CRISPR-SAM系統(tǒng)來增加人類白色前脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性UCP1的表達，共設(shè)計了四種不同的指導(dǎo)RNA靶向人類UCP1上游約50至150bp基因和穩(wěn)定表達的編碼dCas9的載體與病毒蛋白轉(zhuǎn)錄激活子的四個串聯(lián)重復(fù)序列融合。將CRISPR-SAM系統(tǒng)與gRNA A到D的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到源自兩個受試者的人類白色前脂肪細(xì)胞中。gRNA-A使UCP1 mRNA 增加約6000倍，使UCP1蛋白增加約20倍。這些發(fā)現(xiàn)表明，將靶向UCP1的 CRISPR-SAM和sgRNA結(jié)合使用，可以通過開啟內(nèi)源性UCP1表達將人的白色前脂肪細(xì)胞改造成人的褐色樣細(xì)胞。

與缺少sgRNA的原始人類白色脂肪細(xì)胞相比，HUMBLE細(xì)胞在成脂分化后保持了較高的UCP1表達。然而，UCP1在HUMBLE細(xì)胞中的表達略低于同一個人的分化棕色脂肪細(xì)胞。與白色對照組脂肪細(xì)胞相比，HUMBLE細(xì)胞顯示出升高的GLUT1 mRNA。與棕色對照脂肪細(xì)胞相比，HUMBLE細(xì)胞導(dǎo)致線粒體活性和線粒體DNA含量增加。與白色對照脂肪細(xì)胞相比，HUMBLE細(xì)胞顯示出更細(xì)長且連接的線粒體網(wǎng)絡(luò)，類似于棕色對照脂肪細(xì)胞的線粒體形態(tài)。

除了具有棕色對照脂肪細(xì)胞的分子和結(jié)構(gòu)特征外，HUMBLE細(xì)胞還獲得了棕色脂肪樣功能性表型。與白色對照組細(xì)胞相比，HUMBLE脂肪細(xì)胞使用葡萄糖作為底物時，其葡萄糖攝取量、基礎(chǔ)呼吸頻率、質(zhì)子泄漏和福司可林（FSK）依賴性耗氧率（OCR）增加。與白色對照組細(xì)胞相比，它們還具有更高的脂肪酸依賴性O(shè)CR能力，而脂肪酸的攝取沒有改變。使用熱敏熒光染料，研究人員直接測量了培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的熱量，發(fā)現(xiàn)與福司柯林相比，HUMBLE細(xì)胞比白色對照細(xì)胞產(chǎn)生更多的熱量。這些發(fā)現(xiàn)表明，HUMBLE細(xì)胞在使用葡萄糖或脂肪酸作為燃料來源方面具有熱學(xué)能力。

HUMBLE細(xì)胞重構(gòu)小鼠的功能性脂肪細(xì)胞

基因工程或藥理誘導(dǎo)的米色/棕褐色細(xì)胞的移植可改善小鼠體內(nèi)的代謝穩(wěn)態(tài)。為了確定HUMBLE細(xì)胞在體內(nèi)的代謝影響，將白色對照、HUMBLE和棕色對照前脂肪細(xì)胞與Matrigel混合，然后移植到免疫功能低下的裸鼠的胸骨區(qū)域。移植后2周，HUMBLE細(xì)胞在三種移植細(xì)胞系中顯示出最高的螢光素酶信號。到第4周在棕色對照細(xì)胞和HUMBLE細(xì)胞中都檢測到大量的UCP1表達，這表明棕色對照前脂肪細(xì)胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞，且UCP1表達上調(diào)。另外，分別通過小鼠CD31和酪氨酸羥化酶的陽性染色所示，移植的組織變得血管化和受神經(jīng)支配。研究人員在小鼠血清中檢測到人脂聯(lián)素，這表明這些移植物具有可以作為內(nèi)分泌組織分泌脂聯(lián)素或其他因子進入循環(huán)系統(tǒng)的功能?？傊@些數(shù)據(jù)表明，移植的前脂肪細(xì)胞可以在體內(nèi)重構(gòu)脂肪組織，從而在體外概括這些細(xì)胞的表型。

HUMBLE細(xì)胞促進小鼠葡萄糖代謝和生熱

為了研究HUMBLE細(xì)胞是否能預(yù)防小鼠DIO代謝紊亂，研究人員監(jiān)測了移植前2周接受45％高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的受體小鼠的代謝表型。接受HUMBLE和棕色對照脂肪細(xì)胞的小鼠比接受白色對照細(xì)胞的小鼠體重減輕。與接受白色對照細(xì)胞的小鼠相比，使用HUMBLE或棕色對照細(xì)胞移植的小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性也提高了約30％至35％。血清胰島素沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著變化。然而，與接受白色對照細(xì)胞的小鼠相比，在HUMBLE和棕色對照細(xì)胞組中循環(huán)甘油三酸酯的濃度降低了。與接受白色對照細(xì)胞移植的小鼠相比，棕色對照脂肪細(xì)胞移植使小鼠在冷暴露時能夠保持更高的核心體溫。

為了進一步驗證HUMBLE細(xì)胞在體外和體內(nèi)的代謝作用，研究人員使用從另一個個體和相同的CRISPR-SAM系統(tǒng)分離的白色前脂肪細(xì)胞生成了另外的HUMBLE細(xì)胞系。與上述對供體A41產(chǎn)生的細(xì)胞的保護作用一致，由供體A38產(chǎn)生的HUMBLE細(xì)胞在體外也顯示出很高的產(chǎn)熱潛力，并且當(dāng)使用相同方案進行體內(nèi)移植時，其糖耐量、胰島素敏感性和糖耐量均得到改善。這些結(jié)果表明基于CRISPR的HUMBLE細(xì)胞策略適用于不同的人類受試者。

巨大的細(xì)胞移植改善飲食誘發(fā)的肥胖小鼠的新陳代謝

為了檢查使用HUMBLE細(xì)胞治療肥胖癥的潛力，研究人員將細(xì)胞移植到DIO裸鼠中。移植了HUMBLE或棕色對照細(xì)胞的DIO小鼠的體重比移植了白色對照細(xì)胞的小鼠輕，這與葡萄糖耐量和胰島素敏感性的顯著提高以及移植后4周的循環(huán)胰島素濃度降低有關(guān)。與移植了白色對照細(xì)胞的小鼠相比，移植了HUMBLE或棕色對照細(xì)胞的小鼠的肝臟脂質(zhì)含量降低了，內(nèi)源性BAT和皮下WAT中的脂質(zhì)滴大小相應(yīng)降低了?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，HUMBLE細(xì)胞移植可能是潛在的抗肥胖治療策略。

HUMBLE細(xì)胞移植在體內(nèi)激活內(nèi)源性鼠BAT

與具有白色對照細(xì)胞移植的小鼠相比，接受HUMBLE或棕色對照細(xì)胞的小鼠從循環(huán)中清除葡萄糖放射性示蹤劑的速度更快，這歸因于內(nèi)源鼠BAT中葡萄糖的攝取增加，而不是移植細(xì)胞對葡萄糖的攝取增加。內(nèi)源性scWAT或骨骼肌中的葡萄糖攝取或任何上述基因的表達沒有變化。從功能上講，與接受白色對照細(xì)胞的小鼠相比，接受HUMBLE或棕色對照細(xì)胞的小鼠的內(nèi)源性BAT附近的表面溫度更高，提示受體小鼠適應(yīng)性生熱的激活。這些數(shù)據(jù)表明，HUMBLE和棕色對照細(xì)胞可以激活內(nèi)源性BAT。

結(jié)果與討論

在本研究中，研究人員使用CRISPR-SAM系統(tǒng)工程改造了人類白色前脂肪細(xì)胞，以激活內(nèi)源性UCP1基因并驅(qū)動類似棕色的表型。通過利用配對的人類白色和棕色前脂肪細(xì)胞系能夠?qū)⒐こ谈脑斓腍UMBLE細(xì)胞及其同基因的親本白色對照細(xì)胞與同一個體的真正的棕色對照細(xì)胞進行比較，從而提供準(zhǔn)確的表型比較。研究數(shù)據(jù)證明了CRISPR工程化的HUMBLE細(xì)胞在預(yù)防和治療肥胖癥方面的臨床前治療潛力。HUMBLE細(xì)胞的移植可大大改善小鼠體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

在研究中，移植的人類前脂肪細(xì)胞原位分化為脂肪細(xì)胞，更重要的是在肥胖的小鼠模型中，脂肪細(xì)胞功能所需的血管化和神經(jīng)支配得以發(fā)展。此外，移植的細(xì)胞在體內(nèi)存活了至少12周，因此這些細(xì)胞對小鼠體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的有益作用得以持續(xù)。結(jié)果表明，基于HUMBLE細(xì)胞的療法可潛在地用于對抗高熱量飲食引起的代謝紊亂。

此項研究存在一定的局限性，研究人員使用免疫功能低下的裸鼠作為HUMBLE細(xì)胞移植的受體，以避免人類細(xì)胞移植的免疫排斥。但是，免疫受損的小鼠中特異性免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的缺乏可能會影響代謝評估的結(jié)果和解釋。CRISPR這一被稱為“魔剪”的基因編輯工具在基因工程應(yīng)用方面被寄予厚望，其憑借著成本低廉、操作方便以及效率高等優(yōu)點已經(jīng)成為了生物科研的得力助手，但不可否認(rèn)的是CRISPR目前仍然面臨著易脫靶等等的問題與挑戰(zhàn)，美迪西作為新藥研發(fā)CRO也會繼續(xù)關(guān)注基因編輯技術(shù)的發(fā)展，期待CRISPR技術(shù)發(fā)展成熟的那一天，為人類健康貢獻力量。