原位雜交技術(shù)——上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司
原位雜交（insituhybridization）用特定標(biāo)記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)核酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則在原位進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)核酸原位進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸定位。原位雜交可根據(jù)檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)和組織切片原位雜交；根據(jù)其用探針及檢測(cè)核酸的不同可分為DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA雜交。根據(jù)標(biāo)記方法不同可分為放射性探針和非放射性探針。
其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。
(一)取材與標(biāo)本固定
1． 取材 對(duì)于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要盡快固定或冷凍保存。
2．固定 進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)固定處理，固定的目的是為了①保持細(xì)胞形態(tài)原有結(jié)構(gòu)；②最大限度保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；③使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織內(nèi)。
3．固定液 常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)因此要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇最佳的固定液。
4．固定方法 組織標(biāo)本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要時(shí)，動(dòng)物組織可進(jìn)行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過(guò)夜，次日可行冰凍切片。
(二)切片及細(xì)胞標(biāo)本的制備
1．載玻片的處理 因?yàn)樵浑s交一般在載玻片上進(jìn)行，所以載玻片必須保持清潔且不能有任何核酸酶的污染。一般載玻片可先經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可經(jīng)15磅高壓滅菌20min處理，可將載玻片上的核酸酶消除。
2． 組織切片與預(yù)處理
（1）冰凍切片：新鮮組織也可在取材后，直接置入液氮中迅速驟冷，冷凍切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。雜交前切片迅速恢復(fù)至室溫并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加預(yù)雜交液室溫孵育1h。
（2）石蠟切片：組織固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，可長(zhǎng)期保存，隨時(shí)用于原位雜交。雜交前切片經(jīng)①二甲苯脫蠟2次，每次10min；②純酒精洗2次，每次5min；③空氣干燥5min；④梯度酒精復(fù)洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5min；⑥2×SSC洗10min；⑦滴加預(yù)雜交液于濕盒內(nèi)室溫孵育1h。
（3）培養(yǎng)細(xì)胞：每張載玻片滴加200μl濃度為1×105/m1的細(xì)胞懸浮液，空氣干燥1～2min制成細(xì)胞涂片，也可直接用培養(yǎng)細(xì)胞蓋片。上述細(xì)胞片經(jīng)酒精或多聚甲醛固定5min，其余步驟同冰凍切片。
(三)試劑配制
配制溶液過(guò)程中均需戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經(jīng)160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。
1． DEPC水 將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過(guò)夜，15~20min高壓消毒，之后室溫避塵存放。
2． 0.1mol PBS pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4為NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04為Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其濃度達(dá)0.85％。
3． 20×SSC 為NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。
4． 4％多聚甲醛(pH 7.4) 為多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。
5． 緩沖液
（1） 緩沖液Ⅰ(pH 7.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。
（2） 緩沖液Ⅱ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
（3） 緩沖液 Ⅲ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
6． 去離子甲酰胺 將陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂各5g加入50ml甲酰胺中，待樹(shù)脂下沉后用上清液。
7． 50％硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不斷攪動(dòng)使之完全溶解。
8． 50×Denhardt's液 為1％Fico11type 400（聚蔗糖） 0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。
9． 預(yù)雜交液 為去離子甲酰胺5.0m1；20×SSC 2.0m1；鮭魚(yú)精DNA (10mg/m1) ；0.5ml（沸水變性10min）；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％硫酸葡聚糖 2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。
(四)雜交與顯色
1．雜交 將已標(biāo)記的探針加入預(yù)雜交液即成為雜交液（探針濃度為1μg/m1），切片經(jīng)2×SSC短暫浸洗后，滴加雜交液，于濕盒內(nèi)置37℃或42℃孵育過(guò)夜。然后依次經(jīng)2×SSC室溫浸洗1h，l×SSC室溫浸洗lh，0.5×SSC 37℃浸洗30min，0.5×SSC室溫浸洗30min。注意滴加雜交液時(shí)切片勿干燥。
2． 顯色 以下各步均在室溫下進(jìn)行。
（1）緩沖液I洗1min。
（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的緩沖液I孵育切片30min。
（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的緩沖液I稀釋羊抗Dig抗體。
（4）將抗體稀釋液滴加在切片上，封口膜覆蓋，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。
（5）緩沖液I洗10min。
（6）緩沖液Ⅱ洗10min。
（7）加顯色液，封口膜覆蓋，避光室溫孵育2～20h，隨時(shí)鏡檢，當(dāng)顯色滿意時(shí)入緩沖液Ⅲ終止顯色。
顯色液臨用前配，其配方為：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑 2.4mg；④緩沖液Ⅱ 加至10ml。
（8）常規(guī)脫水、透明、封固。
結(jié)果：雜交陽(yáng)性信號(hào)為紫藍(lán)色顆粒。
(五)原位雜交對(duì)照試驗(yàn)
同免疫組織化學(xué)染色對(duì)照一樣，為證明原位雜交實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性，需要設(shè)置一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)，具體的各種對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置及其意義請(qǐng)參考原位雜交專(zhuān)著，以下僅介紹幾種常用的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
1．省去標(biāo)記探針 在做原位雜交時(shí)，以PBS或預(yù)雜交液替代雜交液，結(jié)果應(yīng)為陰性，這是一種簡(jiǎn)便而有意義的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。如省去標(biāo)記探針仍出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，這一定是假陽(yáng)性。
2．自身對(duì)照 用同一組織切片或涂片上與靶序列無(wú)關(guān)的其他結(jié)構(gòu)作對(duì)照。陽(yáng)性與陰性結(jié)構(gòu)同在一個(gè)視野中，相互印證，這本身就是對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)的特異性對(duì)照。
3．陰性對(duì)照 用已知不存在相應(yīng)靶序列的組織標(biāo)本雜交，結(jié)果應(yīng)為陰性。陰性對(duì)照可排除在雜交過(guò)程中由于非特異性雜交反應(yīng)等因素造成的假陽(yáng)性結(jié)果。
4．陽(yáng)性對(duì)照 用已知含靶序列的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，稱陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照可證明雜交過(guò)程中各個(gè)步驟以及所使用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)方法可靠。尤其當(dāng)待檢標(biāo)本為陰性時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照片呈陽(yáng)性反應(yīng)可排除待檢標(biāo)本假陰性的可能。故若預(yù)期雜交結(jié)果為陰性時(shí)，就必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照亦不顯色，就證明雜交過(guò)程的某一步驟或所用試劑問(wèn)題。
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