對 Na?ve Beagle Dog模型中納米金剛石-多柔比星復(fù)合物的安全性評價

2023-03-20

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1. 多柔比星 (DOX)

多柔比星 (DOX) 是一種抗生素，自 1960 年代以來已被廣泛用作化療劑。多柔比星是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，可有效治療多種惡性腫瘤，但美中不足的是會在許多受試者中引起心臟毒性。

2. 納米金剛石 (ND)

納米金剛石 (ND) 是最有前途的化學(xué)療法載體之一，但是，它們往往會在儲存時或者當暴露于 pH 值或離子強度的輕微變化時發(fā)生聚集效應(yīng)。

3. 納米金剛石和多柔比星的化合物(ND-DOX)

作為一種有效且廣泛使用的化療劑，多柔比星在臨床應(yīng)用中因劑量毒性而影響使用范圍，包括累積的心臟毒性和骨髓抑制。低劑量或緩慢釋放多柔比星可以預(yù)防此類副反應(yīng)，從而實現(xiàn)長期化療。由于缺乏特異性和靶向遞送，納米藥物遞送系統(tǒng)可用作克服毒性。納米金剛石具有高的細胞吸收率和低的細胞毒性，此外，多柔比星可以在堿性條件下通過物理吸附可逆地負載到納米金剛石上。因此，納米金剛石是設(shè)計高效藥物遞送納米載體和治療系統(tǒng)的有前途的策略。

發(fā)生耐藥和藥物外排是癌癥治療的兩個重要限制因素。納米金剛石遞送系統(tǒng)可以避免運輸?shù)鞍椎南模⒈Ａ糇銐蛄康乃幬锉┞队诩膊〔课弧?/div>

納米金剛石和多柔比星的化合物(NDX)可通過降低早期死亡率和抑制腫瘤生長來提高治療效果，而單獨給藥則沒有明顯的療效，此外，沒有明顯的骨髓抑制。與小鼠肝腫瘤和乳腺癌模型的常規(guī)多柔比星療法相比，NDX 改善細胞凋亡和腫瘤生長抑制，同時降低毒性。 NDX 遞送系統(tǒng)可抑制乳腺癌、轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌的肺轉(zhuǎn)移，并有助于減少獲得化療療效所需的多柔比星劑量。納米金剛石給藥體外和體內(nèi)模型的綜合評價表明，ND-藥物可以延長藥物釋放，加速腫瘤細胞凋亡，減少骨髓抑制等全身副作用。

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Characterization of ND, DOX and NDX complex

4. 使用Na?ve beagle dog 評估納米金剛石-多柔比星復(fù)合物的安全性

在這項研究中，研究人員使用Na?ve Beagle Dog來評估納米金剛石藥物遞送平臺遞送 DOX 的安全性。第 1-3 組的雄性幼齡Na?ve Beagle Dog分別靜脈注射 DOX、ND 和 NDX。第 4 組雌性幼齡Na?ve Beagle Dog通過靜脈注射 NDX。第 5 組雄性幼齡Na?ve Beagle Dog通過肝門靜脈注射NDX。所有治療組均以 3.648 mg/kg 的劑量水平給藥。給藥后，動物隨后進入觀察階段，以評估其健康狀況的可見變化。同時，在給藥前后采集血液和尿液進行綜合分析。結(jié)果表明單獨使用多柔比星會引起嚴重的損傷，而 NDX 可顯著減輕多柔比星的毒性。

Na?ve beagle dog 實驗操作

此項動物實驗是與上海美迪西臨床前研究平臺組聯(lián)合進行的。 13 只 Na?ve Beagle Dog分為 5 組，單次靜脈注射（IV）給予 1 mg/mL 多柔比星（第 1 組）、1 mg/mL 納米金剛石（第 2 組）、 NDX 混懸液（第 3-5 組）。無菌水第 1-4 組靜脈注射，第5組肝門靜脈注射。

第 5 組的動物接受了 HPV 插管手術(shù)，并在進行研究之前恢復(fù)幾天。根據(jù)個體體重給予每只試驗動物的劑量為3.648mg/kg。給藥當天測量體重并記錄。在接下來的五天里，動物可以自由飲水，但在研究結(jié)束時采集血樣之前禁食過夜（至少 10 小時）。

組織病理學(xué)分析

對用多柔比星、納米金剛石和 NDX 處理的Na?ve Beagle Dog進行組織病理學(xué)分析，并對肝臟、脾臟、腎臟、肺和心臟的組織進行蘇木精和伊紅染色。研究人員發(fā)現(xiàn)使用靜脈注射的多柔比星和 NDX 組之間存在顯著差異。

肝臟組織病理學(xué)分析表明，用 DOX 治療的Na?ve Beagle Dog有更大的損傷。死的Na?ve Beagle Dog肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，有出血，肝細胞明顯變性，有炎癥細胞。用多柔比星治療的存活的Na?ve Beagle Dog在肝臟中也有變性和炎癥細胞。NDXHPV組也有一些輕微的退化和結(jié)構(gòu)紊亂。 ND-IV 和 NDX-IV 組的肝臟結(jié)構(gòu)變化輕微或幾乎正常。脾臟方面，用多柔比星處理的Na?ve Beagle Dog出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，用納米金剛石處理的Na?ve Beagle Dog基本上是紅髓，變性明顯。此外，用 NDX-HPV 治療的Na?ve Beagle Dog表現(xiàn)出脾臟血竇擴張和退化。 NDX-IV組的脾臟變化輕微。

腎臟組織切片顯示，用多柔比星治療的Na?ve Beagle Dog顯示血管有血瘀和炎癥細胞。用納米金剛石處理過的Na?ve Beagle Dog的腎臟出現(xiàn)輕度至中度變性，間質(zhì)纖維出現(xiàn)增生。 NDX-HPV組的小管不規(guī)則。在用 NDX-IV 治療的Na?ve Beagle Dog的腎臟中僅觀察到微小變化。

肺部組織切片進一步顯示，用DOX治療的Na?ve Beagle Dog肺泡內(nèi)有大量滲出物，肺毛細血管內(nèi)有出血和淤滯。 NDXHPV組肺泡壁有炎性變性，肺泡上皮增生，而ND-IV和NDXIV組Na?ve Beagle Dog肺僅有輕度病變。

用NDX-IV治療的Na?ve Beagle Dog的心臟未見明顯異常，而用DOX-IV、ND-IV和NDX-HPV治療的Na?ve Beagle Dog顯示心肌細胞變薄、間質(zhì)水腫、心肌炎的證據(jù)。總之，基于組織形態(tài)學(xué)的結(jié)果表明，對于用 NDX-IV 治療的Na?ve Beagle Dog，每個器官的病變都是輕微的。其他治療組的肝、脾、腎、肺、心臟均有較明顯的一定程度的損傷。

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Histopathology of dogs treated with ND, NDX and DOX. Representative

血液學(xué)分析

血液學(xué)分析表明，ND-IV-M、NDX-IV-M、NDX-IV-F 和 NDX-HPV-M 不會引起白細胞、血小板計數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞的顯著變化。同時，納米金剛石或 NDX 不會引起亞急性炎癥。平均紅細胞血紅蛋白和平均紅細胞血紅蛋白濃度分析表明，DOX、ND 和 NDX 組在正常范圍內(nèi)幾乎沒有波動。這些結(jié)果表明，在納米金剛石和 NDX 組中，IV 和 HPV 注射均沒有明顯的血細胞完全破壞跡象。

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Complete hematology profiles of dogs treated with ND, NDX and DOX.

尿液分析

所有Na?ve Beagle Dog的尿液樣本在給藥前后進行了測試。尿液pH值是腎臟調(diào)節(jié)酸堿平衡的指標。數(shù)據(jù)顯示，尿液 pH 值和尿液比重在給藥前后沒有明顯波動。但NDXM組尿蛋白明顯升高，提示腎炎發(fā)生。注射納米金剛石溶液36小時和60小時后Na?ve Beagle Dog的尿液表現(xiàn)出相同的變化趨勢。熱量釋放峰面積隨時間增加表明更多的 ND 被排出。更重要的是，研究人員通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察了納米金剛石的顆粒，這證實了納米金剛石可以隨尿液排出。

Urinalysis analysis

總結(jié)

雖然多柔比星 (DOX) 是治療癌癥最常見的化療藥物之一，但由于劑量相關(guān)的毒性，必須謹慎管理 DOX 的使用。據(jù)報道，與 DOX (NDX) 結(jié)合的納米金剛石 (ND) 藥物遞送系統(tǒng)可增強小鼠癌癥模型的治療效果并減弱毒性。此外，廣泛的生物相容性研究表明，非人類靈長類動物似乎對 ND 具有良好的耐受性。在NDX臨床轉(zhuǎn)化之前，有必要驗證ND在大型哺乳動物中的安全性。大型動物的納米藥物安全性研究并不常見，這項工作代表了將早期進展連接到臨床評估的關(guān)鍵里程碑。在此，NDs 作為藥物輸送平臺的安全性在 Na?ve Beagle Dog中進行了評估。該研究使用 DOX、ND、和 NDX 在雙性別動物模型中使用靜脈 (IV) 注射和肝門靜脈 (HPV) 注射方法。連續(xù) 5 天監(jiān)測Na?ve Beagle Dog的健康表型變化。獲得的血液和尿液用于臨床病理學(xué)研究。結(jié)果表明，ND 給藥平臺顯著減輕了 Na?ve Beagle Dog模型的 DOX 毒性。本研究為大型動物水平的 NDX 治療的臨床前安全性評估提供指導(dǎo)。

本研究綜合評估了使用 DOX、ND 和 NDX 處理的雙性別Na?ve Beagle Dog模型。此外，驗證了同性別Na?ve Beagle Dog之間的 HPV 和 IV 注射。不同給藥處理的共同研究結(jié)果表明，多柔比星單獨使用會對Na?ve Beagle Dog的肝臟、脾臟、肺和腎臟器官造成損害。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，NDX-IV組沒有明顯的器官損傷。 NDX-HPV 組通過組織形態(tài)學(xué)和血液分析表明對肝臟和脾臟有輕微但可觀察到的副作用。此外，設(shè)法在尿液中檢測到 ND，這表明其代謝途徑可能是通過泌尿系統(tǒng)。這些研究為 NDX 治療的臨床前安全性評估提供了重要基礎(chǔ)。為癌癥患者又提供了一種新的有前途的臨床替代方案。

參考文獻:

[1] Raven El Khoury , et al. Demonstration of doxorubicin's cardiotoxicity and screening using a 3D bioprinted spheroidal droplet-based system. RSC Adv. 2023 Mar 13;13(12):8338-8351. doi: 10.1039/d3ra00421j. eCollection 2023 Mar 8.

[2] Moustafa S Ali, et al. Towards more efficient inhalable chemotherapy: Fabrication of nanodiamonds-releasing microspheres. Int J Pharm. 2022 Oct 15;626:122169. doi: 10.1016/j.ijpharm.2022.122169.

[3] Liping Wang, et al. Safety evaluation of nanodiamond-doxorubicin complexes in a Na?ve Beagle canine model using hematologic, histological, and urine analysis. Nano Research. 2022.15: 3356–3366.

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