單B細(xì)胞抗體制備

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• 單克隆抗體(mAb)是許多診斷應(yīng)用和研究的重要工具。此外，單克隆抗體已成為許多疾病的理想治療用品，在癌癥、自身免疫性疾病和感染性疾病的治療中得到了很好的應(yīng)用。為了研究和治療目的，已有許多技術(shù)用于生成單克隆抗體。單B細(xì)胞抗體制備技術(shù)是近些年新發(fā)展的一種制備單抗的技術(shù)。該方法具有速度快、通量高、以及抗體重輕鏈可變區(qū)天然配對(duì)的優(yōu)勢，是目前新型、高效的抗體發(fā)現(xiàn)方法之一。

  

  單B細(xì)胞抗體制備的原理是每個(gè)B細(xì)胞只含有一對(duì)功能性的重鏈和輕鏈，每個(gè)B細(xì)胞具有只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，所以可以直接從單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因獲得單抗。

• 單B細(xì)胞抗體制備流程

  

• 單B細(xì)胞分選

  根據(jù)研究應(yīng)用，可以隨機(jī)或抗原選擇性地從外周血或淋巴組織(如骨髓、脾臟)中分離單B細(xì)胞。對(duì)于B細(xì)胞分離，目前單B細(xì)胞分選方式有流式細(xì)胞分選法、 磁珠細(xì)胞分選法、 顯微操作法、 激光顯微切割法以及微流控分選法。 其中流式細(xì)胞熒光分選技術(shù) (Fluorescence activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)是目前一種成熟、 有效的單細(xì)胞分選方法。

  

• 單B細(xì)胞Ig基因轉(zhuǎn)錄,擴(kuò)增,測序

  從單個(gè)B細(xì)胞中構(gòu)建互補(bǔ)DNA (cDNA)為同時(shí)分析表達(dá)的IgH和IgL鏈基因提供了一種正確的方法。通常，單B細(xì)胞cDNA合成是在用于細(xì)胞沉積和細(xì)胞裂解的設(shè)備中進(jìn)行的(例如96孔板、納米孔芯片等)，這確保了方便處理大量樣品并將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。全長Ig可變區(qū)基因轉(zhuǎn)錄物通過巢氏PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中RT-PCR產(chǎn)物可作為第一輪PCR的樣品進(jìn)行進(jìn)一步反應(yīng)。

  無論使用何種Ig可變區(qū)基因擴(kuò)增策略，編碼抗體特異性的單B細(xì)胞Ig可變區(qū)基因轉(zhuǎn)錄信息隨后通過測序得到。然后利用各種數(shù)據(jù)庫，如NCBI的IgBLAST、IMGT，可以很容易地識(shí)別和分析重排的V、D和J基因片段是否存在突變、插入和缺失。

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