開篇引言

藥物固態(tài)表征方法有很多，X射線粉末衍射（XRPD）、熱重分析（TGA）、差示掃描量熱（DSC）、紅外（IR）、拉曼（Raman）、固態(tài)核磁（ssNMR）、動(dòng)態(tài)水分吸附（DVS）、熱臺(tái)顯微鏡、掃描電鏡（SEM）、偏振光顯微鏡（PLM）。其中，XRPD憑借快速、直觀、樣品用量少，樣品不被破壞可回收的優(yōu)點(diǎn)，已成為藥物晶型研究的首選表征方法及金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛用于藥物固態(tài)的定性和定量等研究，貫穿藥物固態(tài)研究的各個(gè)階段。

FDA Guidance: X-ray powder diffraction can also be used to provide unequivocal proof of polymorphism.

i. 《中國(guó)藥典》2020年版第四部0451專門闡述了藥品研究中X射線衍射法的應(yīng)用；9015則指明了藥品晶型研究及晶型質(zhì)量控制。
ii. 美國(guó)藥典（USP）941章節(jié)介紹了有關(guān)Characterization of Crystalline and Partially Crystalline Solids by X-Ray Powder Diffraction (XRPD)。
iii. 歐洲藥典（EP 10.8）在《5.9 Polymorphism》和《5.16 Crystallinity》中對(duì)晶型定義闡明了XRPD用于藥物晶型表征。
iv. 日本藥典（JP XVII）中收錄了晶型描述以及XRPD表征方法。

01 X射線衍射法和原理

X射線衍射法（XRPD, X-ray powder diffraction）是一種利用單色X射線光束照射到被測(cè)樣品上，檢測(cè)樣品的三維立體結(jié)構(gòu)（含手性、晶型、結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑）或成分（主成分及雜質(zhì)成分、晶型種類及含量）的分析方法。其原理是：X射線是一種高能電磁波，能夠穿透物質(zhì)并與其中的原子或者分子產(chǎn)生相互作用。當(dāng)X射線照射原子排列規(guī)律不同的固體時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的衍射圖譜。因此，不同晶型的XRPD譜圖往往差異很大，具有指紋屬性，易于區(qū)分，如圖1所示。

圖1. 幾何測(cè)量原理圖

02 X射線粉末衍射（XRPD）圖的組成

X射線粉末衍射圖是化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)間接信息，變化萬(wàn)千，隨物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同而異。那么，該如何解讀衍射圖？

組成X射線粉末衍射圖的三要素為：峰位、峰強(qiáng)、峰形（線形）。衍射峰強(qiáng)受晶體結(jié)構(gòu)、樣品特性（擇優(yōu)取向、吸收、孔隙率）和儀器參數(shù)影響。晶型是由化合物的晶胞參數(shù)（a,b,c,a,β,γ）定義的，而晶胞參數(shù)（a,b,c,a,β,γ）影響的是衍射峰的峰位置。其他檢測(cè)指標(biāo)如峰強(qiáng)度，則由原子參數(shù)決定，并受到擇優(yōu)取向的影響。

因此，判斷晶型一致性時(shí)，取決于藥物晶型衍射峰的位置，而不是衍射峰的強(qiáng)度或強(qiáng)弱順序。

03 X射線粉末衍射（XRPD）的應(yīng)用

1、區(qū)分晶態(tài)物質(zhì)和非晶態(tài)物質(zhì)（無(wú)定型）

中國(guó)藥典2020版0451指出，晶態(tài)物質(zhì)的粉末X射線粉末衍射峰是由數(shù)十乃至上百個(gè)銳峰（窄峰）組成；而非晶態(tài)物質(zhì)的粉末X射線粉末衍射峰的數(shù)量較少且呈彌散狀（為寬峰或饅頭峰），如圖2所示。

圖2.某一化合物結(jié)晶態(tài)和無(wú)定型的XRPD對(duì)比圖

2、鑒別多晶型

當(dāng)某一化合物有兩種或兩種以上的不同固體物質(zhì)狀態(tài)時(shí)，即存在有多晶型（或稱為同質(zhì)異晶）現(xiàn)象。

多晶型現(xiàn)象可以由樣品的分子構(gòu)象、分子排列規(guī)律、分子作用力等變化引起，也可由結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑的加人（數(shù)量與種類）形成。不同晶型的XRPD圖在衍射峰數(shù)量、衍射峰位置、衍射峰強(qiáng)度以及衍射峰的形狀上顯現(xiàn)出差異。

化合物的每一種晶型都會(huì)產(chǎn)生一種特有的X射線粉末衍射圖，XRPD圖可以作為晶體的指紋圖譜，用于鑒定區(qū)分不同晶型，如圖3所示。

圖3. 某一化合物不同晶型的XRPD對(duì)比圖

3、評(píng)估物質(zhì)的結(jié)晶度

當(dāng)化合物結(jié)晶狀態(tài)比較好、結(jié)晶度比較高時(shí)，XRPD圖基線水平，峰形尖銳。反之，結(jié)晶度低時(shí)，基線不水平，出現(xiàn)漫散包，峰不尖銳，峰形寬化。

結(jié)晶度用來(lái)表示物相中結(jié)晶態(tài)物質(zhì)所占的比例，同一種晶型，一般結(jié)晶度越高，熔點(diǎn)越高，如圖4所示。

圖4.同一晶型不同結(jié)晶度的XRPD對(duì)比圖

04 XRPD在晶型鑒別方面常見的問題

多數(shù)情況下，晶型的判斷并不困難。只要其XRPD譜圖一致（所有的衍射峰位置一致），就可以判斷為同一晶型。但是在實(shí)際晶型鑒別中，我們也會(huì)經(jīng)常遇到以下問題：

i：?jiǎn)我痪瓦€是混晶？
ii：相似的XRPD圖，晶型是否一致？
iii：XRPD多峰或者少峰，晶型該如何判斷？
iv：XRPD峰偏移，晶型該如何判斷？
v：XRPD峰分叉晶型又該如何抉擇？

1、培養(yǎng)單晶，通過和單晶模擬的粉末衍射圖比對(duì)

單晶是判斷晶型是否為單一晶型最直接的方法。通過培養(yǎng)目標(biāo)晶型的單晶，然后通過單晶數(shù)據(jù)模擬XRPD譜圖，與實(shí)測(cè)XRPD譜圖進(jìn)行對(duì)比。如果一致，則說(shuō)明是單一晶型，如圖5所示。

圖5. 某化合物單晶模擬和實(shí)測(cè)的XRPD對(duì)比圖

2、通過不同的結(jié)晶方式，獲得多批次樣品的XRPD

若多批次重結(jié)晶實(shí)驗(yàn)（采用不同的結(jié)晶方式，不同的溶劑體系）獲得樣品的XRPD圖一致，那么就可以認(rèn)為是單一晶型，如圖6所示。

圖6.某化合物不同結(jié)晶方式獲得的XRPD對(duì)比圖

3、結(jié)合不同表征技術(shù)進(jìn)行全面的表征

DSC等輔助手段也可以用于是否單一晶型的判斷。如果是單一晶型，那應(yīng)該有單一的熔化峰。如果DSC檢測(cè)有兩個(gè)或者多個(gè)熔化峰，則有可能是混晶。NMR、TGA、KF等則可以對(duì)水合物、溶劑化物的情況進(jìn)行判斷。

4、晶型標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比

和對(duì)照品XRPD圖對(duì)比，和專利文獻(xiàn)報(bào)道的XRPD譜圖對(duì)比，以確定當(dāng)前制備的晶型是混晶還是單一晶型。

同種物質(zhì)（單一成分或者包含溶劑）的不同晶型可能晶體結(jié)構(gòu)相似。比如無(wú)水物和水合物之間，不同含水量的水合物之間，無(wú)水物和溶劑合物之間，水合物和溶劑合物之間，不同的溶劑合物之間就可能晶型結(jié)構(gòu)相似，簡(jiǎn)稱isostructural。

此外，不同物質(zhì)其實(shí)也可能具有相似的結(jié)構(gòu)（即相似的XRPD圖），比如氘代和非氘代化合物，異構(gòu)體。對(duì)于這些情況，僅從XRPD圖譜是很難判斷的。需要結(jié)合項(xiàng)目背景信息，比如合成工藝，結(jié)晶工藝、化合物的多晶型情況，還需要結(jié)合其它表征手段綜合分析，才能得到客觀科學(xué)的結(jié)論，如圖7-圖9所示。

圖7.氘代和非氘代的XRPD對(duì)比圖

圖8.對(duì)映異構(gòu)體（蘋果酸）的XRPD對(duì)比圖

圖9.某新藥不同溶劑合物的XRPD對(duì)比圖

在進(jìn)行晶型一致性判斷時(shí)，少峰的情況（與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比）相對(duì)問題較小，可以認(rèn)為是該批次樣品可能由于結(jié)晶情況與以往批次不同，導(dǎo)致某個(gè)或者某些晶面結(jié)晶度比較低，因而沒有出峰。比較難判斷的是XRPD譜圖多峰的情況，出現(xiàn)多峰的情況，一定要引起重視。

擇優(yōu)取向常發(fā)生在片狀和針狀晶體。比較極端的情況，某些比較弱的衍射峰會(huì)消失，但對(duì)其研磨后衍射峰會(huì)出現(xiàn)。無(wú)論是片狀晶體還是針狀晶體，在研磨后，樣品的形貌會(huì)趨向于不規(guī)則和隨機(jī)的分布，此時(shí)每個(gè)晶面暴露在X射線下的概率也會(huì)趨向于一致，所以XRPD衍射峰就沒有明顯的擇優(yōu)取向。當(dāng)然，研磨有可能會(huì)導(dǎo)致樣品結(jié)晶度下降，甚至變?yōu)闊o(wú)定形，所以研磨時(shí)要注意研磨的強(qiáng)度和時(shí)間，如圖10-圖13所示。

圖10.混晶引起的XRPD多峰圖

圖11.外來(lái)物引起的XRPD多峰圖

圖12.溶劑引起的XRPD多峰圖

圖13.擇優(yōu)取向引起的XRPD多峰圖

峰偏移經(jīng)常發(fā)生在水合物脫水前后或者樣品熱處理前后的XRPD圖上。非化學(xué)計(jì)量比水合物與對(duì)應(yīng)的無(wú)水晶型具有相似的晶體結(jié)構(gòu)，只有少數(shù)衍射峰有差異。脫水后，晶格收縮，晶面間距減小，導(dǎo)致衍射峰右移。

同樣，溫度對(duì)于XRPD的位置也有影響。熱脹冷縮是一個(gè)物質(zhì)的基本屬性，同樣適用于晶體。根據(jù)布拉格公式2d sin θ=n λ，溫度升高，晶體膨脹，在波長(zhǎng)不變的情況下，晶面間距d值增大，必然使sin θ 變小，即峰位左移。

另外，樣品受到擠壓，產(chǎn)生均勻的顆粒應(yīng)變，比如壓片，亦可能導(dǎo)致峰位右移。具體如圖14和圖15所示。

圖14.水合物脫水引起的XRPD峰偏移圖

圖15.受熱和應(yīng)力存在引起的XRPD峰偏移圖

在XRPD譜圖分析時(shí)，如果遇到峰裂分等情況時(shí)，可能是顆粒表面粗糙度、顆粒太大、晶體結(jié)構(gòu)缺陷等因素引起，研磨再測(cè)試可以解決大部分的問題。具體如圖16所示。

圖16.氯化鈉不同顆粒大小引起的XRPD峰分叉圖

05 美迪西的技術(shù)和服務(wù)

美迪西藥物固態(tài)開發(fā)技術(shù)平臺(tái)具有專業(yè)和經(jīng)驗(yàn)豐富的鹽型/共晶篩選、晶型篩選、單晶培養(yǎng)和結(jié)構(gòu)解析、晶型定性定量研究團(tuán)隊(duì)。團(tuán)隊(duì)主要負(fù)責(zé)人曾擔(dān)任多年的固態(tài)表征CNAS授權(quán)簽字人，擁有10年以上固態(tài)表征分析技術(shù)經(jīng)歷，上百個(gè)API或制劑中API的晶型定性研究經(jīng)驗(yàn)，能夠?yàn)榭蛻籼峁└咝?yōu)質(zhì)的固態(tài)表征技術(shù)服務(wù)，賦能您的藥物開發(fā)。

[1] 《中國(guó)藥典》(2020年版)中0451 X射線衍射法
[2] ?941? CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE AND PARTIALLY CRYSTALLINE SOLIDS BY X-RAY POWDER DIFFRACTION (XRPD).
[3] PECHARSKY V K, ZAVALIJ P Y. Fundamentals of Powder Diffraction and Structural Character of Materials [M]. Spring-er, 2005:161.

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