高效液相制備純化技術(shù)是一種在生物醫(yī)藥行業(yè)中非常關(guān)鍵的純化技術(shù)，利用不同的化學(xué)性質(zhì)來(lái)分離混合物中的各種組分。在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域，完整的雜質(zhì)研究和充分的雜質(zhì)控制，直接關(guān)系到藥品的安全性和有效性，是藥物成功獲批的重要因素之一。

然而，雜質(zhì)研究的難點(diǎn)在于識(shí)別和控制那些在生產(chǎn)過(guò)程中或穩(wěn)定性研究中產(chǎn)生的未知且頑固的雜質(zhì)。這些雜質(zhì)的生成機(jī)制復(fù)雜，結(jié)構(gòu)未知，難以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行追蹤和分析。在這一挑戰(zhàn)面前，制備液相技術(shù)成為解決難題的利器。作為一種高效的分離技術(shù)，HPLC能夠從復(fù)雜的樣品中分離出微量的雜質(zhì)，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定和毒性評(píng)估提供了可能。這不僅解決了雜質(zhì)研究中的關(guān)鍵難題，也為藥品的安全性和有效性提供了更為堅(jiān)實(shí)的保障。

美迪西云講堂邀請(qǐng)工藝分析部李墨，為您深入解析HPLC操作的關(guān)鍵注意事項(xiàng)，并提供解決常見(jiàn)操作難題的策略和方法。

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01 剛提到的降低柱溫用來(lái)增加化合物保留，但是我遇到過(guò)升高柱溫化合物保留也增加的情況，這是什么原因呢？

李墨：在色譜分析中，通常降低柱溫，溶質(zhì)的保留時(shí)間會(huì)增加。在少數(shù)情況下，我們化合物的保留時(shí)間會(huì)隨著溫度增加而增加，原因可能是溶質(zhì)分子產(chǎn)生了離子化，或者跟溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，或者固定相可能會(huì)隨著溫度改變，都可能導(dǎo)致保留時(shí)間的增加。

02 制備樣品的溶解性要怎么試？有什么好的建議呢？

李墨：首先拿到樣品之后，建議是先咨詢合成部門同事，詢問(wèn)化合物是從什么溶劑中旋蒸出來(lái)的，了解化合物的原始溶劑。或者進(jìn)行嘗試，可以稱取幾個(gè)約10毫克的樣品于進(jìn)樣小瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)行溶解性測(cè)試。向每個(gè)樣品中加入100微升的稀釋劑，觀察其溶解性。如果樣品不溶，可以逐步增加稀釋劑量。如果觀察到樣品在中性條件下不溶，可以考慮加入少量的酸或堿以幫助溶解。常用的溶劑一般可以考慮使用甲醇乙腈，如果這些溶劑無(wú)法溶解樣品，可以嘗試更通用的溶劑，如二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）或N-甲基吡咯烷酮（NMP）。這些試溶解性的樣品后續(xù)可以用來(lái)進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，也不浪費(fèi)樣品。

03 什么是預(yù)飽和？目的是什么？

李墨：預(yù)飽和技術(shù)在色譜分析中扮演著重要的角色，其主要目的是保護(hù)色譜柱，并維持其性能的穩(wěn)定性。預(yù)飽和可以防止色譜柱內(nèi)的固定液流失，在流動(dòng)相進(jìn)入色譜系統(tǒng)之前，預(yù)飽和柱會(huì)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行處理，使其與固定液充分接觸，達(dá)到飽和狀態(tài)。飽和之后再進(jìn)入分析柱當(dāng)中，就會(huì)防止分析柱中的固定液流失，從而保持我們色譜柱的性能不變。

04 保護(hù)柱不能超聲應(yīng)該怎么清洗？

李墨：直播提到保護(hù)柱不能夠劇烈超聲，是因?yàn)榭赡軙?huì)對(duì)填料產(chǎn)生一定損傷，如果保護(hù)柱出現(xiàn)污染，可以將其擰開(kāi)并拆開(kāi)，取出柱芯，使用50%異丙醇溶液進(jìn)行清洗，以去除表面吸附的樣品。發(fā)生一些強(qiáng)污染的時(shí)候，可以像常規(guī)的色譜柱一樣進(jìn)行單獨(dú)的沖洗，把污染物沖出來(lái)。要注意定期檢查保護(hù)柱的理論塔板數(shù)，以評(píng)估柱效是否下降。同時(shí)注意壓力是否異常上升，這些可能是更換保護(hù)柱的信號(hào)。由于保護(hù)柱屬于耗材，當(dāng)性能下降時(shí)，只需更換柱芯，無(wú)需更換整個(gè)色譜柱，這樣可以節(jié)省成本并保持分析的連續(xù)性。

05 結(jié)構(gòu)類似物實(shí)戰(zhàn)中用哪些柱子分離呢？

李墨：選擇哪種色譜柱取決于待分離分子的化學(xué)性質(zhì)、大小、極性以及所需的分辨率和選擇性。比如對(duì)于苯環(huán)類化合物，特別是鹵代苯（如氯苯、溴苯等），使用苯基柱可以提高分離效果，對(duì)于苯環(huán)上的取代基團(tuán)位置不同，也可以考慮使用五氟苯基柱等等。

06 怎么解決峰型異常的問(wèn)題？比如分叉峰之類

李墨：在色譜分析過(guò)程中，我們可能會(huì)遇到一些常見(jiàn)的問(wèn)題，如樣品過(guò)載、溶劑使用不當(dāng)、色譜柱污染或失效等。這些問(wèn)題都可能會(huì)導(dǎo)致峰型異常，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。解決辦法可以考慮使用降低樣品的載樣量，比如降低它的濃度，或者減少樣品的進(jìn)樣體積，或者更換樣品溶劑等等，如果色譜柱出現(xiàn)污染或效能降低，更換新的色譜柱可以恢復(fù)分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

07 李墨老師特別分享：保留因子K的公式推導(dǎo)過(guò)程
保留因子k：用固定相中的溶質(zhì)分子總量，除以流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子總量來(lái)得到。流動(dòng)相和固定相中的分子量等于樣品的濃度(Cs和Cm表示)乘以相的體積(Vs和Vm表示),因此可以引導(dǎo)出等式
k=(CsVs)/(CmVm)=( Cs/Cm)/( Vs/Vm)
=KΨ（k是平衡常數(shù)，Ψ是流動(dòng)相和固定相的比值）
溶質(zhì)分子肯定會(huì)出現(xiàn)在固定相或者流動(dòng)相里,假設(shè)流動(dòng)相里的溶質(zhì)分子分?jǐn)?shù)為R，在固定相的溶質(zhì)分子分?jǐn)?shù)就應(yīng)該是1-R，因此就可以得到
k=(1-R)/R    
或者
R=1/(1+k)   
溶質(zhì)分子X(jué)的保留時(shí)間可以定義為距離除以速度，這里的距離就是色譜柱的長(zhǎng)度L，色譜帶的速度是ux:
tR=L/ux
同樣地,溶劑峰的保留時(shí)間就是
t0=L/u
式中,u是流動(dòng)相的平均速度。把等式的L去除之后就衍生出下面這個(gè)等式
tR=t0u/ux
溶質(zhì)分子X(jué) 通過(guò)色譜柱時(shí)的移動(dòng)速率或者速度ux，可以通過(guò)計(jì)算在任何時(shí)間里出現(xiàn)在流動(dòng)相內(nèi)的該分子的分?jǐn)?shù)R 來(lái)得出。一般來(lái)講，ux應(yīng)該等于R 乘以移動(dòng)的速率或者溶劑分子的流動(dòng)速度U:
ux=Ru0
所以用ux=Ru和R=1/(1+k)進(jìn)行取代tR=t0u/ux,就得到下面的等式
k=(tR/t0)-1
式中tR 為化合物保留時(shí)間，t0為死體積時(shí)間

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